水产养殖学专业实践教学体系

 

一、 指导思想

内江师范学水产养殖学专业以“以发展为中心、教学做统一” 为指导思想，围绕“应用技术型”人才培养目标，依据行业和企业的生产环节和技术要求，整合理论课程教学内容，构建鱼类生物学与资源、鱼类繁殖和养殖、饲料生产和检测、水质分析化验、病害诊断和防治技术、营销与管理技能为载体的专业技术实践教学体系，形成以校内实验教学、专业技能训练、科研训练，校外见习和实习、社会实践为载体的专业实践培养体系，实现专业与行业对接、课堂与生产对接、教师与技师对接、实训与企业对接的“产教融合、校企协培”的实践教学模式，着重培养学生的专业应用技术和专业技术应用能力。

二、构建原则

1、目标性原则。

实践教学体系的构建必须紧紧围绕学校应用型人才培养的定位和“应用技术型”培养目标进行，旨在通过“产教融合、校企协培”的人才模式达成满足现代水产行业所需的水产养殖人才、技术营销人才、渔业管理人才的培养目标。

2、系统性原则。

传统的实践教学基本上是依附于单一理论课的验证性实验，其特点是操作的演示性、单一性，综合性和设计性实验偏少；即使开设综合实验或者创新性实验，也是局限在本门理论课程中。将课程间一脉相承的专业系统知识和技能分割开来讲授或训练，只能培养学生注重掌握书本中实践知识和技术，较难培养学生融会贯通所学的专业知识，综合应用分析多门专业课程解决生产实际问题的能力。通过整合与优化专业基础课、专业发展必修课及专业发展选修课, 创建多门课程融汇贯通的综合实践教学体系，打通相关课程实践教学的壁垒；以生产环节和行业技术流程要求，梳理实践教学内容及内在联系、去冗补缺；依据水产养殖的产业链类别，系统地重构实践教学体系；在强化基本实践技能和素质基础上，着重培养学生专业应用技术和专业技术应用能力。该实践教学体系注重各实践教学内容的相互配合、相互支撑和互相渗透，与理论教学内容和课程板块相适应。

3、生产性原则。

    传统的实践教学主要参考上世纪90年代或本世纪编制的参考资料，这些参考资料对于培养学生的入门的实验知识和能力非常有效。但随着数以万计的水产私营企业快速发展，呈现出规模化、专业化和多样化特点，且现在水产养殖品种多样化、复杂化，养殖理念和形势从已有了深刻变化，转变为多样、高产、低碳、安全和环保的养殖模式。以简单、陈旧的参考教材培养学生的实践技能和理念已不能满足现在水产行业对人才需求的多样化和专业化，出现课堂实践教学与养殖生产、水产养殖企业的需求脱节。

实践教学中的上述问题，制约了学生的实践积极性，在一定程度上埋没了学生的专业修养和创新能力，学生的专业技能和解决实际生产问题的能力低下、片面，以致出现水产毕业生远不能满足水产企业机构和水产工商企业对水产人才的需求，而相当一部分毕业生找不到合意的工作, 造成水产人才资源的浪费的矛盾。因此，依托校内水生生物与水化学教学实验室、水产动物营养与饲料实验室、水产养殖综合实验室、水产动物疾病与防治实验室、水产电子商务实训室、鱼类分类与资源实验室，校外大型综合性实践教学平台（依托通威集团的“鱼类繁育、养殖、饲料、病害、渔业设施” 校企联合的“产学研”实训中心；依托利洋水产科技有限公司的“鱼类病害防治与水质调控技术”实训中心；依托无锡渔愉鱼科技有限公司的“电子商务、营销、管理”实训中心；依托眉山水产渔政局的水产苗种繁育技术实习教学基地群及众多的企业实践教学平台）（表1）， 聘请企业技术骨干担任校外实践教学指导教师，实现专业与行业对接、课堂与生产对接、教师与技师对接、实训与企业对接的“产教融合、校企协培”的实践教学模式，将专业理论知识由抽象、通用、教条、被动转化为具体、特定、灵活、鲜活的生产应用知识、技术和技能传授给学生，提高学生分析问题和解决问题的能力，最终实现理论知识向综合能力转变。

4、“产教融合、校企协培”的原则

为保障“产教融合、校企协培”过程的教学质量，依托现有20余家合作企业的生产经营业务和实践教学大纲内容，探索和优化“六个专业学科知识”和“实践教学体系”在校内和企业实践环节中的教学内容、前后衔接关系，构建实践教学体系中与企业生产直接相关的实践教学内容；以应用技术为导向，不断完善和优化生产应用性的系统化实践教学体系。

不断强化和提高校内教师的执业（水产养殖业）技能，吸收具有“工匠”技能的行业技术骨干进入校内和基地实践环节，构建一支“双师双能型”实践教学队伍，依托企业实践平台和岗位，力争企业实践实训实现“学徒式”指导。筛选约5家在平台、师资、实践模式、实践内容优良的企业，依托“水产养殖学农科教合作人才培养实践基地”项目，培育打造，逐步建成2-3个具有示范效应的校企一体、产学研一体的大型实验实训实习中心，以实际行业生产和服务为导向，着重培养学生专业应用技术和专业技术应用能力。依托企业管理经营人才和案例，培养学生的创新创业能力与素质。

三、体系目标

培养热爱水产养殖专业，具有自然科学、人文社科素质，掌握水产动物增养殖、病害防治、营养与饲料、渔业水域环境调控、水族科学与技术、水产企业经营管理等理论知识及应用技术，能在水产养殖、饲料和渔药、渔业资源与环境、休闲渔业等相关行业从事生产、服务、研发、经营管理、销售等工作，能适应行业变化和发展的应用技术型人才。毕业生能熟练运用鱼类分类、鱼类繁殖和养殖、饲料生产和检测、水质分析化验、病害诊断和防治技术，具备营销与管理技能，成为现代水产行业所需的水产养殖人才、技术营销人才、渔业管理人才。

四、体系内容

1、体系总体框架

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 2、体系具体内容

附表1 水产养殖学专业学生能力结构与实践环节

能力层次	序号	能力项目	实践教学课程/环节
基础技能	1	社会适应能力	思想道德修养与法律基础、形势与政策、大学生心理健康教育等
	2	计算机应用能力	大学计算机
	3	外语应用能力	大学外语听力、口语、阅读、写作
	4	信息检索与写作能力	信息检索
水产养殖专业技能	1	实验操作能力	鱼类学实验、水生生物学实验、养殖水化学实验、鱼类遗传育种学实验、名特水产养殖学实验、水产微生物学实验、水产动物疾病学实验、水产动物营养与饲料学实验
	2	专业运用与研究能力	水产行业入门见习、养殖环境生物学及鱼类学课程实习、水产养殖生产实习、水族科学实训、毕业综合实习

 

附表2 实践课程（环境）的实验项目（内容版块）与能力目标

版块一:鱼类生物学及资源板块实践

 

实验一 鱼类外部形态及构造（3学时）

一、实验目的：

1、了解鱼类体型的多样性及其与生活环境、生活习性的相互关系；

2、了解并掌握鱼类外部器官的进化及其生活习性的关系；

3、了解与掌握鱼体各部位分区及测量的一般方法；

4、熟悉鱼类分类学所习见的某些外部形态术语的含义；

5、了解鱼鳍的形态结构特征及其功能，掌握鳍式；

6、了解鳞的形态结构特征，掌握鳞式。

二、实验原理：

    不同鱼类因其适应环境的方式不同，造就了鱼类体型的多样性。通过鱼体3个体轴：头尾轴、背腹轴和左右轴长度的变化，可将鱼类的体型大致分为纺锤形、侧扁形、平扁形和圆筒形4种基本体型，并在这4种基本体型的基础上发展出多种其它体型（如带型、翻车型、海马型等）。尽管鱼类外部形态多种多样，仍可分为头部、躯干部和尾部三个部分。鱼类头部器官较多，且形态多样，主要有吻、口、鼻、眼、鳃裂、须等，各器官所在的位置与形态根据类群和种类的不同而差异显著。

    鳍和侧线是鱼类躯干部和尾部的主要外部器官。鳍参与鱼类的运动和身体的平衡身体；侧线是鱼类的感觉器官。鳍可分为偶鳍和奇鳍，为了表述鱼类鳍的有无和组成特点，人们往往使用鳍式来描述鱼类鳍的种类、鳍条类别及其数目。真骨鱼类鳞片的表面结构、形状、大小、排列方式及数目等，在一定范围内是固定的，鳞片的数目也是鱼类分类的常规测量项目，人们常用鳞式来表示鱼类鳞片的特征。

三、实验器具与材料

材料：鲜活的鲫、黄鳝、鲢、鲇；

      鳐、鲤、鲈、银鲳、带鱼、鱵、鮟鱇、大菱鲆、带鱼、海马等浸制标本。

试剂：甲醛。

仪器和用具：解剖盘、镊子、量鱼板、直尺、天平。

四、实验步骤

（一）鱼类体型的观察与比较

（二）鱼类头部器官的形态观察与比较

1、观察鱼类吻的形态特征

2、观察鱼类的口的形态特征

3、鱼类眼的形态特征

4、鱼类鼻孔的形态特征

（三）鱼体各部位的分区与测量

1、常规鱼类各部分的分区与测量

2、鲨、鳐类各部分的分区与测量

（四）鱼鳍及鳍式

（五）鱼鳞及鳞式

五、作业

1、在鲤外形图上并标注各部分分区的名称；

2、测量鲤全长、叉长、体长、体高、体宽、头长、吻长、躯干长、尾部长、尾柄长、尾柄高。

3、试比较鱼类的口型与其生活习性的关系；

4、按标准书写、计算鲤的鳍式、鳞式；

5、试述鱼类的各种鳍对其行为的作用和分类中的地位。

实验二 鱼类的形态解剖探究（9学时）

一、实验名称：鱼类的形态解剖探究

二、实验学时：9学时

三、实验类型：设计性实验

四、实验目的与要求：

1. 鱼类的生物多样性丰富，其形态与鱼类分类、生理、生态研究密切相关。通过对不同鱼类形态结构的比较，了解鱼类形态结构与机能，以及对水环境的适应。本实验项目旨在培养学生创新意识、独立思考、分析和解决问题的能力。

2. 实验要求：4-6人/组，每人3-5种鱼，对某器官或系统进行解剖。组内讨论分析，在教师指导下选择研究课题、制定研究方案，明确分工。结果组内共享，分析比较独自撰写。

五、实验内容：

1. 由学生自行设计一个从对几种鱼某器官或系统进行解剖的实验方案，写出操作步骤并说明实验原理。（学生拟定的设计性实验的实验方案或实验步骤，以统一的格式，写成书面方案（或实验步骤），其内容应包括文献查阅（综述）、理论分析或研究、实验方案（目的、设备、方法、步骤等）。书面方案（或实验步骤）应经过指导教师审查同意。）

2. 画出实验总的流程图。

3. 列出实验所需的化学试剂、材料、主要仪器和玻璃器皿的名称、数量和规格。

4. 写出配制实验所需试剂的主要操作步骤。

5. 写出实验中主要注意事项。

6．准备实验所需的化学试剂、材料、主要仪器和玻璃器皿。

7. 配制实验所需试剂。

8. 按实验流程实施自己的实验方案。

六、实验实施过程：

1．实验课开始前3周，向学生布置实验题目、内容和实验要求, 启发学生查阅文献，以课题小组为单位设计实验方案并说明实验原理。

2．实验实施前1周，收集学生的实验方案，由教师进行审阅。

3．实验实施开始前，组织一个讨论会，由各课题组提出自己的实验方案，讨论、归纳最终形成一个最合理可行的实验实施方案。

4．学生从调整仪器、配置试剂开始，完全自己动手完成实验方案的实施。

5．实验完成后学生独立完成实验报告并进行答辩汇报。

七、成绩评定办法

本项目成绩由实验方案设计、实验报告及答辩三部分组成，其中答辩成绩包括组内自评、组间互评和教师评分三部分组成。

八、作业

以论文的方式完成实验报告的撰写。

九、参考文献

孟庆闻 苏锦祥 李婉瑞. 鱼类比较解剖.北京：科学出版社，1987.

孟庆闻，苏锦祥. 白鲢的系统解剖.北京：科学出版社，1960.

秉志. 鲤鱼解剖.北京：科学出版社，1960.

李仲辉，杨太有．大口黑鲈和尖吻鲈骨骼系统的比较研究．动物学报．2001，47(专刊)：110-115

陈晓峰.两种石斑鱼骨骼系统比较解剖. 厦门大学硕士学位论文. 2008.

杨太有, 李仲辉. (鱼句)亚科花(鱼骨)型鱼类骨骼系统的比较. 动物学杂志. 2006, 41(2).

孟庆闻 中国鲤科鱼类脑颅的比较研究 1985

陈星玉 中国雅罗鱼亚科的骨骼系统及其分类学意义 1987(03).

杨世勇.廖宇峰.杨坤.严太明.杜宗君 齐口裂腹鱼头骨系统解剖.西南农业学报2012(4).

杨太有.李仲辉.范念斯 沟鲹骨骼系统的研究——兼与鲹科某些种类比较.河南师范大学学报（自然科学版）2011(1). 

孟庆闻，苏锦祥，李婉端．鱼类比较解剖学．北京：科学出版社，1987。

孟庆闻，苏锦祥．白鲢的系统解剖。北京：科学出版社，1960。

秉志．鲤鱼解剖．北京：科学出版社，1960。

孟庆闻，李婉端．鲱科鱼类的消化系统和鳔的比较研究．动物学报．1983，Z8(4)：383-388。

王迎春，周勤，段晓英．八种海产硬骨鱼类消化系统的比较解剖研究．海洋与湖沼通报．1997，(3)：46-5l。

曾端，叶元土．鱼类食性与消化系统结构的研究．西南农业大学学报．1998，20(4)：361-364。

刘怀如，张耀光．南方鲇消化系统的解剖．泉州师范学院学报(自然科学)．200l，19(6)：75-79.

陈康贵，王志坚，岳兴建．长薄鳅消化系统结构研究，西南农业大学学报．2002，24(6)：487-490。

秉志．鲤鱼解剖．北京：科学出版社，1960。

孟庆闻，苏锦祥．白鲢的系统解剖，北京：科学出版社，1960。

孟庆闻，苏锦祥，李婉端．鱼类比较解剖学。北京：科学出版社，1987。

张善庆，孙帼英．大银鱼脑的结构．解剖学杂志．1998，2l(4)：284，287。

王典群. 细鳞鲑神经系统的初步观察. 兰州大学学报;1986年03期.

李仲辉，路纪琪，王玉，李玉玲. 河南鲤科鱼类脑的形态学研究(Ⅱ). 四川动物;1997年03期.

黄静.贝氏高原鳅与玫瑰高原鳅中枢神经系统的大体解剖及组织学比较研究. 西南大学硕士学位论文，2012.

实验三 鱼类的器官组织学探究（9学时）

一、实验目的

    通过观察鱼类器官系统的组织结构，更好地了解四大基本组织在组成器官和系统时之间的结构与功能关系。

二、实验原理

    组织学是研究正常机体微细结构及其功能关系的科学。鱼类正常生命活动各项功能的实现都是由组成各器官系统内组织的结构和细胞的种类决定的。为了适应环境，不同生活习性、食性、生活水层鱼类的相应器官组织结构都各不相同。

三、实验器具与材料

材料：鱼类各系统永久组织装片

试剂：香柏油，

仪器和用具：光学显微镜，擦镜纸、玻片盒，展片板

四、实验步骤

（一）鱼类消化系统的组织结构观察：食道切片的观察；胃切片的观察；肠道切片的观察；肝脏切片的观察；胆囊切片的观察。

（二）鱼类呼吸系统的组织结构观察：鳃切片的观察；鳔切片的观察；

（三）鱼类排泄系统的组织结构观察：肾脏切片的观察；输尿管切片的观察；膀胱切片的观察

（四）鱼类神经系统的组织结构观察：各部脑组织结构的观察。

五、作业

拍摄鱼类各系统的组织结构图，并注明各部分名称。

六、探究课题

1、鱼类消化道各部分组织结构有何不同？

2、鱼类皮肤结构在应激与正常状态下有何差异？

3、疾病引起的鱼类血液组分及差异与正常组有何不同？

 实验四 市售养殖鱼类的分类、鉴定及检索表的编写（9学时）

一、实验目的

1、掌握鱼类的主要分类特征，学习鱼纲的分类方法；

2、学会使用和编写检索表；

3、认识常见的市售鱼类。

二、实验原理

    鱼类在脊椎动物中的种类最多，如何根据鱼类进化关系和系统发育情况对种类如此繁多的鱼类进行识别物种、分门别类一直以来是科研工作者热衷的研究问题。根据动物的本来面目，客观反映动物的系统发生地位和亲缘关系，是现代分类体系的主要分类方法。

三、实验器具与材料

材料：内江市水产市场市售鱼类。

仪器和用具：相机，记录本

四、实验步骤

（一）市售鱼类的调查；

（二）市售鱼类的鉴定；

（三）市售鱼类的检索表编写；

（四）根据鱼鳃，鳍，鳞的结构与位置和体形，吻形，尾形，眼，侧线等特征对照参考图和下列检索表对实验鱼进行分类，检索，鉴定。

5、常见经济鱼的形态结构特征识别

五、作业

利用检索表鉴定所调查鱼类，并根据分类地位对结果进行检索表编写。

实验五 鱼类胚胎发育的观察（9学时）

一、实验目的

    通过观察养殖场（实验基地）特有鱼类受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚等不同发育阶段的外形特征，掌握鱼类从受精卵到神经胚、器官系统发育等胚胎发育过程中的形态结构变化，为鱼类的增养殖学习与实践奠定基础。

二、实验原理

    鱼类胚胎发育和孵化的时间具有种的特点：而在种的范围内，孵化速度还受到环境条件，诸如水温、溶氧、光照、pH以及病害的影响。一般，鱼类的胚胎发育对非生物环境因子都有一定的适应范围。例如温度，超过适温范围，就会导致胚胎发育中止或畸形，在适温范围内，胚胎发育速度与温度约呈正相关。所以，要提高受精卵的孵化率，应当注意摸索和提供适宜的环境条件。

三、实验器具与材料

材料：养殖场（实验基地）特有性成熟亲鱼；

试剂：胶水，酒精；

仪器与用具：尼康体式显微镜，凹玻片，恒温水浴锅，擦镜纸，牙签，解剖针。

四、实验步骤

（一）受精卵获取与处理

（二）胚胎发育分期观察

（三）注意事项

1、观察胚胎发育时注意记录胚胎发育的温度；

2、胚胎发育到达某时期后记录时间并拍照

五、作业

拍照记录所观察鱼的胚胎发育图，并注明各发育时期。

实验六 沱江（内江段）的X鱼个体生态学研究（9学时）

一、实验目的

1、掌握传统的依据形态学特征鉴别种群的原理和方法；

2、掌握用鳞片鉴定鱼类年龄的方法；

3、掌握研究鱼类食物组成和摄食强度的基本方法；

4、掌握鱼类的性腺发育和繁殖力测定的方法。

二、实验原理

    调查鱼类种群的生物学特性，及其和环境因子的联系；并结合实验室研究，是鱼类生态学研究的主要内容和基础。鱼类种群生物学特性主要包括种群的形态学性状、年龄和生长、食性和摄食强度、性腺发育、繁殖力和繁殖行为及数量变动等各个方面。通过在野外随机采集一定数量的标本在实验室研究可以对所采集标本的资源量、年龄与生长状况、食性、繁殖力等进行分析评估。

三、实验器具与材料

材料：沱江（内江段）的X鱼（300尾）；

试剂：甲醛、氨水（或苛性碱、或硼酸）、硝酸银（或没食子酸、墨水、苦味酸、红色素）；

仪器和用具：显微镜、手术剪、镊子、放大镜、解剖盘、解剖针、载片、滴管、小玻瓶、培养皿、两脚规、直尺、天平、吸水纸、牙刷、生物学资料登记表。

四、实验步骤

（一）种群形态学性状的测定

1、编码并登记：鱼名、编号、渔获日期、地点、渔具、测定人、测定日期等

2、传统测定项目：

（二）以鳞片为材料鉴定鱼类年龄

1、取身体左右两侧、侧线上方的鳞片各5-10片，依次贴在纸上，记录好头、尾、左、右方位，包好。

（三）鱼类的食物组成和摄食强度的测定

1、摄食强度

2、食性的定量分析

（四）鱼类的性腺发育和繁殖力的测定

1、繁殖力测定取样

2、怀卵量的计数

3、计算绝对怀卵量、相对怀卵量

五、作业

1、种群形态学性状分析

种（属）的特征：种属名，所属科、目；形态描述；背鳍鳍式，鳞式，鳃耙数，全长范围及均值；头长／体长，体高／体长，体宽／体长，吻长／头长，眼径／头长，尾柄长／尾柄高。

2、种群的年龄结构和生长状况分析

年龄组成，年龄与体长的相关关系（在坐标上点点描线说明），体长和体重的相关关系（在坐标上点点描线说明），建立鲫鱼体长与体重相关式和绘出相关曲线

体长与体重的相关式一般采用 W=aL^b

求出a、b值，并绘出标准曲线，根据所求方程，可以推算任一体长下的体重或相反，并对结果进行分析与讨论。

3、食性分析：

（1）描述实验鱼种摄食器官和消化器官的形态构造，初步分析鱼种的食性；

（2）根据所摄取食物种类、出现率，列出分析实验鱼种的食性类型。

（3）根据充塞度和饱满指数两种指标，列表分析实验鱼种在实验当月的摄食强度。

（4）根据食物的定量检查，作图分析各种食物成分在消化道中所占的重量百分组成。

4、种群的繁殖力分析

性别组成，性成熟年龄、体长范围，性腺发育时期，性成熟系数，估测繁殖力（相对怀卵量）

5、在1-4的基础上对该水域渔业资源作出客观评价：综合分析该批渔获物性比、年龄组成；不同年龄（或体长）组雌雄鱼当月性腺发育期相，不同发育期相成熟系数的范围和均值，并由此推定该批渔获物初次性成熟年龄，各龄组性成熟百分比；不同发育期相卵巢内卵粒的卵径范围、均值；裂表统计不同年龄或体长组绝对和相对怀卵量范围和均值，并和上届同学、其它水域的资料进行比较分析。

 

版块二:养殖环境实践

 

实验一 不同养殖水体氮指标的测定（6学时）

一、实验目的

    熟悉紫外可见分光光度计的使用方法；掌握水体中总氮、氨氮与硝酸盐氮的测定方法和步骤。

二、实验原理

总氮：在120℃~124℃的碱性基质条件下，用过硫酸钾作氧化剂，不仅可将水样中氨氮和亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐，同时将水样中大部分有机氮化合物氧化为硝酸盐。而后，用紫外分光光度法分别于波长220nm与275nm出测定其吸光度，按下式计算硝酸盐氮的吸光度，A=A₂₂₀-2A₂₇₅，从而算出总氮含量，其摩尔吸光度系数为1.47×10³L/(mol*cm)。

 

氨氮：在亚硝基铁氰化钾的存在下，铵在碱性溶液中与苯酚和次氯酸盐生成蓝色化合物，在625nm处比色定量。

三、仪器与试剂

仪器：高压灭菌锅、水浴锅、分光光度计及配套比色皿、25ml具塞比色管、容量瓶、移液管、纱布、橡皮筋。

试剂：

（一）总氮：

1，碱性过硫酸钾溶液：40g K₂S₂O₈+15gNaOH →溶于无氨水中→稀释至1000ml定容即可。溶液放在聚乙烯瓶内，可贮存一周。

2，1+9盐酸

3，硝酸钾标准溶液：

（1）硝酸钾标贮备液：0.7218g以烘干4小时（105~110℃）硝酸钾溶于无氨水中，定容至1000ml，加入2ml三氯甲烷作为保护剂，可至少可稳定6个月。此溶液含硝酸盐氮100ug/ml。

（2）硝酸钾标准使用液：将贮备液稀释10倍即可。此溶液含硝酸盐氮10ug/ml。

（二）氨氮：

1，硫酸铵标准储备液：0.0472g(NH₄)₂SO₄溶于100ml容量瓶（含氮100μg/ml）。2，硫酸铵标准使用液：将储备液稀释10倍（10μg/ml）。

3，A试剂：5g苯酚和25mg二水合亚硝基铁氰化钾溶解、定容至100ml。

4，B试剂：2ml次氯酸钠溶液（NaClO）和2.5g NaOH溶解、定容至100ml。

四、操作步骤

（一）总氮：

1，标准曲线的绘制：

（1）分别吸取0、0.5、1.00、3.00、5.00ml的硝酸钾标准使用溶液于25ml比色管中，用无氨水稀释至10ml标线。

（2）加入5ml碱性过硫酸钾溶液，塞紧磨口塞，用纱布及纱绳裹紧管塞，以防蹦出。

（3）比色管置于压力蒸汽消毒器中，加热0.5h，放气使压力指针回零。然后升温至120~124℃开始计时。       

（4）自然冷却，开阀放气，移去外盖。取出比色管并冷却至室温。

（5）加入1+9盐酸1ml，用无氨水稀释至25ml标线。

（6）在紫外分光光度计上，以新鲜无氨水作参比，用10mm石英比色皿分别在220nm及275nm波长处测定吸光度。用校正的吸光度绘制标准曲线。

2，样品的测定步骤：取适量经预处理的水样（使氮含量为20~80ug）。按标准曲线绘制步骤（2）-（6）操作。

（二）氨氮：

1，标样准备：向5支比色管中分别加入硫酸铵标准使用液（含氮10μg/ml）0.00，0.10，0.20，0.40，0.80 mL，加水稀释至总体积10ml。

2，标样、过滤水样10ml，加A试剂、B试剂各1.25ml，50℃水浴20min，冷却，测定OD625。

五，作业：1，用EXCEL绘制TN和NH₄-N的标准曲线，并计算出水样中两种指标的大小。

2，计算水样中非离子氨的浓度。

附：

分光光度计使用：

1，使用前先预热20-30分钟（即开机）

2，测定前先用纯水归零吸光值

3，每次测定后需用纯水冲净，并用不掉纸屑的纸轻轻吸干表面水分（不能擦）再加下一个样品。

实验二 养殖水体正磷酸盐的测定（3学时） 

一、实验目的

    了解正磷酸盐的来源；掌握钼酸铵分光光度法的测定原理；掌握钼酸铵分光光度法测总磷与正磷酸盐的基本操作。

二、实验原理

    在中性条件下，过硫酸钾溶液在高压釜内经120℃以上加热，产生如下反应： K₂S₂O₄+H₂O→2KHSO₄+[O] 从而将水中的有机磷、无机磷、悬浮物内的磷氧化成正磷酸。在酸性介质中，正磷酸与钼酸铵反应，在锑盐存在下尘成磷钼杂多酸后，立即被抗坏血酸还原，生成蓝色的络合物，在700nm波长下均有最大吸收度。

三、仪器与试剂

高压灭菌锅、水浴锅、分光光度计与配套比色皿、25ml具塞比色管、移液枪、纱布、橡皮筋。

1，抗坏血酸100g/L：5g抗坏血酸于50ml水（现配）。

2，钼酸盐：溶解13g钼酸铵（(NH4)6Mo7O24？4H2O）于100ml水；溶解0.35g酒石酸锑钾（KSbC4H4O7？H2O）于100ml水；在不断搅拌下，把钼酸铵溶液徐徐加到300ml硫酸(1:1)中；再加入酒石酸锑钾溶液，混匀；贮存于棕色试剂瓶，在冷处可保存二个月。

3，磷标准储备溶液：称取0.2197g KH2PO4（110℃干燥2h，干燥器中冷却），溶解、定容（加5ml 1:1硫酸）至1000ml(含磷 50mg/L)；玻璃瓶中可贮存至少六个月。

4，磷标准使用液：取5.0ml储备液稀释至250ml（含磷1.0mg/L），使用当天配制。

四、实验步骤

（一）总磷

1，向6支25ml比色管中分别加入0，0.2，0.4，0.6，1.0，2.0 mL磷酸盐标准溶液(1.0ug/ml)，加水稀释至10ml标线。

2，标样、未滤水样（10ml），加4ml过硫酸钾，混匀，120℃消解60min（排出冷空气后开始计时），冷却后稀释至25.00ml，然后进行显色反应，即加1ml抗坏血酸混匀，30s后加2ml钼酸盐摇匀，反应15min，测定OD700。

 3，计算：扣除空白试验的吸光度后，以校正后的吸光度对应相应磷含量统计回归校准曲线，并计算水样总磷值。

（二）正磷酸盐：

1，水样的预处理：若水样混浊，用离心机或过滤，取清液使用。每个样品取10ml于25ml比色管中。

2，向,6支25ml比色管中分别加入0，0.1，0.2，0.6，0.8，1.0 mL磷酸盐标准溶液(1.0ug/ml)，加水稀释至10ml标线。

3，在标样与水样中加0.4ml抗坏血酸混匀，30s后加0.8ml钼酸盐摇匀，反应15min，测定OD700。（注：如显色时室温低于13℃，可在20-30℃水浴上显色15min即可）

4，校正吸光度值后绘制标准曲线，并计算水样正磷酸盐含量

五、作业

1，填表并绘制标准曲线

 

2,水样浓度

A=                 校准A=         TP=              PO₄-P=

六、注意事项

1， 水中砷将严重干扰测定，使测定结果偏高。

2，含Cl化合物高的水样品在消解过程中会产生Cl2。对测定产生负干扰，含有大量不含磷的有机物会影响有机磷的消解转化成正磷酸。此类样品应选用其他消解方法。例如：HNO3—HClO4方法消解样品。

3，过硫酸钾溶解比较困难，可于40℃左右的水浴锅上加热溶解，但切不可将烧杯直接放在电炉上加热，否则局部温度到达60℃过硫酸钾即分解失效。

实验三 养殖水体亚硝态氮及COD的测定（6学时） 

一、实验目的

熟练使用分光光度计；掌握亚硝酸盐氮的测定原理和方法。

掌握酸性高锰酸钾法测定COD的原理、测定条件、注意事项和计算；熟悉滴定操作；了解COD测定的意义。

二、实验原理

在酸性介质中亚硝酸盐与磺胺进行重氮化反应，其产物再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色偶氮染料，在543nm波长处测定吸光度。本方法最低检出浓度(以N计)为0.02μmol/L，测定上限为10μmol/L。

样品中加入已知量的高锰酸钾和硫酸，在沸水浴中加热30min，高锰酸钾将样品中的某些有机物和无机还原性物质氧化，反应后加入过量的草酸钠溶液还原剩余的高锰酸钾，过量的草酸钠再用高锰酸钾溶液回滴。

    适用于氯离子含量不超过300mg/l的水样。当水样的高锰酸钾指数值超过10mg/l时，则酌情分取少量试样，并用水稀释后再进行。

三、仪器与试剂

主要仪器：分光光度计及配套比色皿、25mL具塞比色管、25mL酸式滴定管、铁架台（带蝴蝶夹）、250mL锥形瓶、沸水浴装置、移液管、定时装置。

试剂：

1.     磺胺溶液（10g/L）：1g磺胺，溶于72mL盐酸溶液（1+6）中，用纯水稀释至100mL，贮于棕色试剂瓶中，有效期为2个月。2. 盐酸萘乙二胺溶液（1g/L）：称取0.1g盐酸萘乙二胺，溶于适量水后定容至100mL，贮于棕色试剂瓶中置冰箱内保存，有效期为1个月。3. 亚硝酸盐氮贮备溶液（0.5mg/ml）：称取0.12315g亚硝酸钠（NaNO₂，于110℃烘干），溶于少量纯水中后全部转移入250mL容量瓶中，加纯水至标线，混匀。4. 亚硝酸盐氮使用溶液(5μg/ml；5mg/L)：取1.000mL贮备液于100mL容量瓶中，用纯水稀释至标线，混匀。临用前配制。

5.高锰酸钾贮备液(0.1mol/L)：称取0.8g高锰酸钾，溶于0.3升水中，加热煮沸，使体积减少到约0.25升，在暗处放置过夜。若有沉淀出现，取上清液贮于棕色瓶中备用。

6.高锰酸钾使用液(0.01mol/L)：吸取0.1mol/L 高锰酸钾溶贮备液50mL，于500mL容量瓶中，用纯水稀释至标线，摇匀，贮于棕色瓶中。使用当天应进行标定。

7.（1+3）硫酸：将1份浓硫酸缓缓加入到3份纯水中并趁热滴加高锰酸钾标准溶液至微红色。

8.草酸钠标准贮备液：称取1.67625 g在105-110℃烘干1h并冷却的优级纯草酸钠溶于水，移入250ml容量瓶中，用水稀释至标线。此溶液浓度为0.100mol/L，置4℃保存。

9.草酸钠标准使用液：吸取50ml上述草酸钠溶液移入500ml容量瓶中，用水稀释至标线。

四、操作步骤

（一）亚硝酸盐氮的测定

1. 制作标准曲线（1）取6支25mL具塞比色管，分别加入下表所示体积的亚硝酸盐氮标准使用溶液:0、0.5、1、2、3、4ml加纯水至25ml标线，混匀，相当于每根比色管中亚硝酸盐的浓度分别为：0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/L。（2）每支比色管中分别加入0.5mL磺胺溶液，混匀。（3）分别加入0.5mL盐酸萘乙二胺溶液，混匀，放置显色15min。（4）在波长543nm波长处，用10mm比色皿，以纯水作参比，测定吸光度。（5）以校正吸光度Ai’为纵坐标，绘制吸光度对亚硝酸氮质量浓度的标准曲线。2. 水样测定   取适量（10ml）水样于比色管中，用纯水定容到25mL（注意：有稀释步骤，最后计算水样实际浓度时要考虑将25ml的浓度回归到10ml中），参照标准曲线制作过程的步骤（2）～（4），显色并测定该水样的吸光度A水样。

（二）COD的测定

1，0.01mol/L KMnO4标准溶液标定：吸取25.00毫升0.01N草酸于250ml锥形瓶中，加入纯水约25毫升，加入5ml 1:3H2SO4，小心加热至70~80℃间（温度不能高于85 ℃以免草酸分解 ），用以待标的0.01NKMnO4溶液滴定，直至微红色30秒内不退，即为终点，记下高锰酸钾溶液的用量V2。按下式求得高锰酸钾溶液的校正系数K：

 

 

 

2，准确量取100.0mL摇匀的水样，置于250mL锥形瓶中（测平行双样），加入1+3硫酸溶液5.0mL，摇匀，准确加入10.00mL 0.01mol/L高锰酸钾溶液摇匀。

3，立即将锥形瓶置于沸水浴内加热30min（水浴沸腾，开始计时）。沸水浴液面要高于反应溶液的液面。

4，取出锥形瓶，迅速加入10.00mL 0.01mol/L草酸钠溶液，摇匀，溶液变为无色。趁热用高锰酸钾使用液滴定至刚出现粉红色，并保持30s不退色。记录消耗的高锰酸钾溶液的体积V1  。

五、作业1. 绘制标准曲线和求算回归方程：采用相应软件（如Excel）处理标准曲线数据并绘图，横坐标为亚硝酸氮浓度（mg/L），纵坐标为系列标准溶液的校正吸光度Ai’，所得标准曲线应为通过原点的直线，同时可求得直线回归方程：

 

 

2.计算所测水样的亚硝酸氮和COD含量

实验四 几种便携式水质分析仪器的使用（3学时）

一、实验目的

了解水产养殖常用的便携式水质分析仪的原理，掌握其使用范围与方法。

二、实验原理

在水产养殖方面多数采取经验法，即利用目测比较，随意性很大，在生产实践中，由于现场检测缺少精确的分析，导致量化的精度较低。而实验室检测成本高、周期长、数据参数数量有限，应用效果也不尽如人意。便携式水质分析仪由于性能优异、体积轻巧、便于携带、易于操作，可适当弥补上述两种方法的缺憾。

一般便携式水质分析仪主要采用分光光度法，使其波长范围可以达到300-900nm，并具备波长自动选择功能。便携式水质分析仪中纳入了被程序化的上百种不同的校准曲线和比色测量曲线，可对色度、酸度、碱度、铜、铬、氟、镍、碘、锰、铁、镉、余氯、氧化物、磷、硫酸盐、钾、氨氮、硫化物、二氧化硅、硝酸盐、亚硝酸盐等多个参数进行分析测试。

溶氧仪原理： 探头由一个柱状的银阳极和一个环形的黄金阴极组成。使用时，探头末端需注满电解液，该溶液含有少量的表面活性剂以增强其湿润作用。探头前端覆盖有一片渗透性膜，把电极与外界分隔开，但气体可进入。当一极化电位施加于探头电极上时，透过薄膜渗透进来的氧在阴极处产生反应并形成一道电流。  氧气渗透过薄膜的速率与膜内外间的压力差成正比。由于氧气在阴极处迅速消耗掉，所以可假设膜内的氧气压力为零。因此，把氧气推进膜内的压力与膜外的氧气分压成正比。当氧气分压变化时，渗进膜内的氧气量也相应变化，这就导致探头电流亦按比例改变。

pH计，又称酸度计，利用原电池的原理，即两个电极的电极电势的不同，产生电势差，从而使电子流动，产生电流的原理来测定溶液中的氢离子浓度，从而测定pH。原电池两个电极间的电动势不仅与电极自身属性有关，还与溶液里氢离子浓度有关系，因此电动势和氢离子浓度间有一个对应关系。玻璃电极的功能是建立一个对所测量溶液的氢离子活度发生变化作出反应的电位差。把对pH敏感的电极和参比电极放在同一溶液中，就组成一个原电池。如果温度恒定，这个电池的电位随待测溶液的pH变化而变化。

三、实验材料、仪器与试剂

YSI 550A溶氧仪、Sartorius普及型pH计（PB-10）、亚硝酸盐测试仪、哈希DR900便携式多参数比色计、便携式硬度测试仪。

四、实验步骤

1，开机

2、校准

3、样品测试

4、数据读出

五、作业

1，请说明便携式水质分析仪器的工作原理。

2，用溶氧仪和pH计测定鱼塘3个代表性鱼池的水温、溶解氧含量、pH值。

实验五 内江市区景观水体水质调查及营养状态评价（11学时）

一、实验目的

    通过对内江市区景观水体的水质进行调查，并对被调查水体的水质现状及营养状态进行了评价，掌握相关水化学指标的测定及分析方法。

二、实验原理

    水体环境富营养化引起的蓝藻水华问题在我国已日趋严重。淡水湖泊如滇池、太湖、巢湖每年夏秋季都会爆发蓝藻水华。近些年，一些小型的观赏娱乐性湖泊或景观水体也发生了不同程度的富营养化，导致蓝藻的爆发，引起了人们的关注。景观水体是市区精神文明建设的基础，为居民生活营造了优美的休闲环境。通过调查内江市市区景观水体水质状况，对污染程度进行分析并对其营养状态进行评价，以了解该地区景观水体污染现状，为控制该地区水体富营养化及水华的发生，保护城市休闲区域水环境提供参考。

三、实验器具与材料

    采水器、水样瓶、YSI 550A溶氧仪，pH计（PB-10），紫外-分光光度计，测定总磷、总氮、氨氮、化学需氧量(COD_Mn)、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的相关试剂。

四、实验步骤

1，设计合理的实验方案

2，对监测水体进行原位透明度、溶氧、pH、水温测定；

3，用采水器采集水样；

4，用原水样测定总氮、总磷、化学需氧量等指标。

5，根据水体用途，分析该水体水质情况。

五、作业

1. 为什么选择这些指标对该水体进行监测？

2. 根据监测结果，判定水质是否符合要求？如果不符合，你会考虑用什么手段进行处理？

5、如何将浮游动物从水样中去除以免影响测定结果？

实验六 不同调控方法对养殖水体水质调控的效果（11学时）

一、实验目的

    通过不同的调控方法，对养殖水体进行水质调控。在初步了解水质调控的原理与技术手段的同时，进一步掌握养殖水质监测重点指标的测定流程与药品配置方法。

二、实验原理

水质好坏关系到养殖的成败。因此，养殖过程中最重要，同样也是最困难的工作就是保持一个对养殖品种来说最佳的水质。要想做好这项工作，首先应该知道水质中可能对鱼、虾造成影响的因素，只有了解这些因素，才能够根据各地实际情况去调控水质，才能逐步将调控水质的水平提高。水质调控的方法大体上可以归为三类：物理、化学以及生物学方法。不同方法对水质的调控能力也大不相同。

三、实验器具与材料

光照培养箱，1L三角瓶，2L烧杯，便携式溶氧仪，紫外-可见分光光度计，pH计，高压灭菌锅，光合细菌，小球藻，水葫芦等。

四、实验步骤

1，实验方案设计

2，选择实验对象水体并采集足够量水样

3，藻种或菌种的活化、植物的清洗、絮凝剂的配置等；

4，用选择的方法处理水样：如藻种或菌种接种、植物的移植、絮凝剂的添加；

5，实验组与对照组初始水质指标的测定；

6，实验组与对照组水质指标的连续监测；

7，综合实验数据，比较并分析实验结果实验材料的准备

五、作业

1. 哪种方法的效果最好？

2. 结合各种方法的优劣，你更倾向于选择什么方法？

实验七 浮游生物现存量的测算（3学时）

 一、实验目的：

1、了解浮游生物定量样品采集、固定与处理流程；

2、掌握浮游生物的计数、生物量的换算方法。

二、实验原理：

不同种类的浮游生物其体积大小与在水体中的数量不同，因此有不同的浓缩方法。浓缩好的样品在计数的时候，也要选择不同规格的计数工具与计数量。

1、浮游植物作为水体初级生产者，营养级最低，作为食物链的开端，其数量一般比浮游动物多，体积也较小。因此在采集水样时，一般采集1L体积，经过沉淀浓缩以后，用0.1mL浮游生物计数框，在40倍镜下以视野计数法计数。

2、浮游动物尽管营养级别高于浮游植物，但其身体由一个细胞构成，体积较小，是轮虫、枝角类等的食物，数量也比较大，因此可以选择与浮游植物相同的方法进行浓缩和计数。

3、轮虫营养级别稍高，体积较大，因此浓缩时可选择与浮游植物相同的方法，但计数框选择1mL规格全片计数。

4、浮游甲壳动物体积大，营养级别高，数量少，在采集时需要过滤浓缩10L-50L水样，以获得较多的个体，并将整瓶样品在5mL浮游生物计数框中计数。

三、实验器具与材料

浮游植物与浮游动物样品、盖玻片、移液枪（0.2、1、5mL）及配套枪头、浮游生物计数框（0.1mL、1mL、5mL）、光学显微镜。

四、实验步骤

（一）浮游植物、原生动物、轮虫、浮游甲壳动物定量样品的特点了解；

（二）浮游生物计数框（0.1mL、1mL、5mL）的使用；

（三）密度与生物量测算：

1、浮游植物、原生动物

2、轮虫

3、浮游甲壳动物

五、作业

1、为什么浮游植物、原生动物可以用相同的方法进行测定？

2、从计数框规格和计数方法，推测一般水体中不同种类浮游生物的密度从小到大怎么排列？

3、将样品加入浮游生物计数框时，如何有效避免气泡的产生？

4、计算样品中各类浮游生物的密度与生物量。

实验八 室外水体浮游生物生态学调查 （8学时）

 一、实验目的：

1、掌握浮游生物定性、定量样品采集的流程以及相关仪器设备的使用方法；

2、进一步熟悉并掌握浮游生物定量方法；

3、了解理化因子与浮游生物的相互作用关系。

二、实验原理：

水体中不同类群的浮游生物有不同的体型和大小，在采集时需采取不同的浓缩方式。个体较小的浮游植物、原生动物和轮虫，可采取重力沉淀的方式进行浓缩，可尽可能的减少去损耗；个体较大的浮游甲壳动物则可以利用25号浮游生物网进行过滤浓缩。         

三、实验器具与材料

溶氧仪、温度计、pH计、透明度盘、甲醛、滴管、碘化钾、碘、采水器、50mL样品瓶、1L样品瓶、浮游植物沉淀器、13号浮游生物网、25号浮游生物网、0.1mL、1mL、5mL浮游生物计数框、光学显微镜。

四、实验步骤

1、认识浮游生物网、有机玻璃采水器的结构与使用方法。

2、了解浓缩鲁哥试剂的配置方法：60g碘化钾+40g碘+100mL水。

3、野外样品采集：小组合作，组成大组，采集浮游生物定性样品、浮游植物+原生动物+轮虫定量样品、浮游甲壳动物定量样品、水化学指标样品。

4、实验室分析浮游生物定量与定性样品，掌握水体中的主要生物种类。

5、实验室分析水化学指标。

6、分析浮游生物与水环境之间的关系，并给出水体评定意见与水质管理意见。

五、作业

1、撰写调查报告。

2、为什么养殖水体中容易出现变色现象？你能举出几种变色现象和引起该现象的生物类群吗？

实验八 单细胞绿藻的分离与小型培养 （9学时）

 一、实验目的：

1、掌握从野外水体中分离单纯化单细胞绿藻的方法；

2、掌握单细胞绿藻保种培养的方法；

3、了解藻类培养基的营养成分与配置方法；

4、掌握单细胞藻类计数的方法。

二、实验原理：

1、单细胞藻类的分离

藻类在自然界中与其他生物混杂在一起。将特定的藻种从含其他生物的群落里分离出来，获得单种或纯种的过程，称之为藻种的分离。

常用的藻种分离方法有平板分离法、微吸管分离法、稀释分离法、梯度离心法、趋向运动法等。其中微吸管分离法在一般实验条件下比较常用，能获得单克隆藻株。传统的微吸管分离法是利用微吸管在显微镜下挑取一个目标藻细胞，并将其转移到无菌培养液中形成一个藻株。该方法适宜于分离个体较大的藻类，较小的藻类用此法较为困难。

改良微吸管分离法是微吸管分离与稀释分离法相结合的一种微藻分离方法，可明显降低传统微吸管分离微藻的难度。将待分离的藻液稀释到一定的浓度，使得理论上微吸管吸取的每一微小水滴中含有一个藻细胞，然后根据微小水滴中藻细胞的实际数量和组成，利用微吸管进行稀释挑取，可快速获得含有目标藻细胞的微水滴。

2，单细胞藻类的小型培养

以保存藻种为目的的小型培养，多采用封闭式不充气一次性培养方式培养。单细胞藻类生长和其他生物一样，与生活环境有密切关系。水环境中的光照、温度、盐度、营养盐、溶解气体、酸碱度及其他生物因子对单细胞藻类的生长和繁殖都有影响。培养时应根据所养微藻的生态适应能力选择合适的条件。

单细胞藻类的培养过程可分为容器和工具的消毒、培养液的配制、接种、培养管理及采收5个步骤。

三、实验器具与材料

25号浮游生物网、凹玻片、载玻片、盖玻片、解剖镜、玻璃管（3-5mm*50mm）、橡皮头、胶头滴管、酒精灯、火柴、培养皿、光照培养箱、藻类培养液、高压灭菌锅、超净工作台、移液枪及配套枪头、光学显微镜、血球计数板。

四、实验步骤

1、藻类样品的采集

绿藻一般在水温20-25℃时数量较多。选择较温暖的春季晴天上午，用25号浮游生物网在小型绿藻较多的水体表层以画∞字的形式捞取水样，待水样中藻类密度达到一定程度后，装入干净的容器中，迅速带回实验室。

2、分离与扩大培养

镜检藻液，如果浓度过大予以稀释，理论上达到微吸管所吸取的每滴藻液中含有1个藻细胞为宜。将藻液水样放在凹玻片上，在显微镜下用微吸管仔细地吸出单个藻体，滴在载玻片上，在显微镜下确认是所要分离的单个藻体后，移入经灭菌的培养液中培养。每天数次观察藻体分裂的情况，如繁殖良好，可以扩大培养成单种。

3、容器与工具的清洗与消毒

将各种玻璃器皿高压灭菌锅，120℃灭菌30min。

4、培养液的配制

用市售浓缩培养液用蒸馏水或自来水进行稀释、消毒、混合后备用。

5、接种与起始细胞浓度测定

用酒精棉把超净工作台、枪、枪头盒、废液瓶等全部擦一遍，再用酒精喷壶喷一遍，关紧，照紫外半小时，再关掉紫外，将工作台开一个小缝隙，开微风让臭氧吹出。酒精棉擦手，点上酒精灯，所有用具都用酒精喷壶喷一下。根据藻母液中藻细胞密度，在超净工作台中以一定比例添加藻液与培养液，混合均匀后取样留待测定起始细胞浓度，并迅速用组培膜（透气封口膜）封住瓶口。以血球计数板测定密度。

6、培养管理

将光照培养箱调至25℃，光照5000lx，光周期12:12培养一周，定期摇动并观察藻液颜色变化。

7、采收

一周后结束培养实验，并用血球计数板计数培养密度。

五、作业

1、改良微吸管分离藻类的关键点有哪些？

2、本实验中，可用水和培养液分开消毒然后混合配制培养液，也可以采用稀释后一起消毒的方法进行，分析两种方法的优缺点。

3、记录藻类生长情况，绘制培养期间的生长曲线。

实验九 不同培养条件对浮游动物培养效果的影响（10学时）

实验学时：10学时

实验类型：设计性实验

实验目的与要求：

1. 掌握浮游动物小型培养的方法；

2. 比较某生态条件（如食物种类或搭配、温度、光照强度、pH……中的一个）的不同对浮游动物培养效果的影响。

3. 培养学生创新意识、独立思考、分析和解决问题的能力。

实验内容：

1. 实验设计与准备

按要求合理设计实验，并准备实验用浮游动物。为了避免不同龄期对培养效果的影响，尽量选择同一母体单克隆产出的同生群浮游动物，即当母体产出第一代幼体后，即将母体移除，当第一代母体产出第二代幼体后，再将第一代母体移除，依次类推，直到所需同步幼体够用为止。从野外水体中采集水样，在体视显微镜下分离出单个个体，按照上述方法获得实验用浮游动物。（学生拟定的设计性实验的实验方案或实验步骤，以统一的格式，写成书面方案（或实验步骤），其内容应包括文献查阅（综述）、理论分析或研究、实验方案（目的、设备、方法、步骤等）。书面方案（或实验步骤）应经过指导教师审查同意。）

2. 浮游动物的接种与实验进行

按每个大组人数，每大组设置3-5个试验组，每组均设3个重复。例如某大组要探讨光照强度对浮游动物的影响，可设置黑暗、弱光、中强光、较强光、强光5个试验组；如果探讨温度的影响，则可设置15℃、20℃、25℃……等试验组。在每个250mL烧杯中放入过滤后的池塘水200mL，并放入相同数量的实验用浮游动物，并记录好初始密度。

3. 浮游动物的培养与管理

实验持续时间2周左右，具体根据结果而定。定时投喂小球藻，每个烧杯投喂量应相同。每天观察浮游动物生长状态，如胃含物多寡、活力等；每隔一定时间计数浮游动物密度。

实验实施过程：

1．实验课开始前3周，向学生布置实验题目、内容和实验要求，启发学生查阅文献，以课题小组为单位设计实验方案并说明实验原理。

2．实验实施前1周，收集学生的实验方案，由教师进行审阅。

3．实验实施开始前，组织一个讨论会，由各课题组提出自己的实验方案，全班讨论、归纳最终形成一个最合理可行的实验实施方案。

4．学生从调整仪器、配置试剂开始，完全自己动手完成实验方案的实施。

5．实验完成后学生独立完成实验报告。

成绩评定办法

设计报告（30%）+试验准备（20%）+试验过程与结果（20%）+实验报告（30%）。

作业

1. 绘制浮游动物生长曲线。

2. 用统计学方法将每组实验数据进行比较，找出培养浮游动物时某一因子的最佳浓度。

3. 浮游动物活力不佳时有哪些可观察到的表现或现象？

4. 以单细胞藻类作为饵料来完成本次实验有什么好处？

实验十 浮游动物对养殖污水修复的研究（10学时）

实验学时：10学时

实验类型：设计性实验

实验目的与要求：

1. 掌握浮游动物小型培养的方法；

2. 掌握同生群浮游动物的获取方法；

3. 通过比较试验选择可利用的高效的修复生物。

4. 培养学生创新意识、独立思考、分析和解决问题的能力。

实验内容：

1、实验设计与准备：包括查阅文献选择浮游动物、设计试验组与对照组等。（学生拟定的设计性实验的实验方案或实验步骤，以统一的格式，写成书面方案（或实验步骤），其内容应包括文献查阅（综述）、理论分析或研究、实验方案（目的、设备、方法、步骤等）。书面方案（或实验步骤）应经过指导教师审查同意。）

2、养殖污水的获取：在实验室内养殖鱼类一段时间后的废水。

3、实验用浮游动物的获取

为了避免不同龄期对修复效果的影响，尽量选择同一母体单克隆产出的同生群浮游动物，即当母体产出第一代幼体后，即将母体移除，当第一代母体产出第二代幼体后，再将第一代母体移除，依次类推，直到所需同步幼体够用为止。

4、初始值的测定：试验前测定养殖污水的各项指标，作为初始值。

5、试验组与对照组

按每个大组人数，每大组设置3-5个试验组和1个对照组，每组均设3个重复。每个烧杯里放入养殖污水200mL，按梯度放入培养好的浮游动物。如果是较大型的甲壳动物，课选择10、20……只，如果动物体型较小，放入的个数应适当增加。将烧杯放入恒温培养箱中，保持温度25±1℃。

6、指标测定

按试验设计定期测试相关主要指标，如氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、溶氧、化学需氧量、总氮、总磷……等。试验持续时间2周左右，具体根据测定指标的结果而定。

实验实施过程：

1．实验课开始前3周，向学生布置实验题目、内容和实验要求，启发学生查阅文献，以课题小组为单位设计实验方案并说明实验原理。

2．实验实施前1周，收集学生的实验方案，由教师进行审阅。

3．实验实施开始前，组织一个讨论会，由各课题组提出自己的实验方案，全班讨论、归纳最终形成一个最合理可行的实验实施方案。

4．学生从调整仪器、配置试剂开始，完全自己动手完成实验方案的实施。

5．实验完成后学生独立完成实验报告。

成绩评定办法

设计报告（30%）+试验准备（20%）+试验过程与结果（20%）+实验报告（30%）。

作业

1、将每组实验数据与对照组比较，求出去除率。

2、用统计学方法比较哪一试验密度的浮游动物对养殖污水净化效果最好。

3、为什么需要培养同生群浮游动物来进行试验？

4、污水中的有机颗粒越多、越大是否越有利于试验的开展？为什么？

实验十二 底栖动物生态学调查（8学时）

一、实验目的：

1、了解底栖动物的采集过程

2、基本掌握底栖动物的采集、保存方法

3、并初步掌握底栖动物的鉴定方法。

二、实验原理

底栖动物是指在水地区栖息的动物总称，一般包括水生环节动物、水生软体动物、甲壳动物和水生昆虫。底栖动物调查的目的在于了解水体中底栖动物的种类组成，分布以及对水体单位面积上底栖动物的平均密度和生物量作出比较可靠的估计，从而为水体中底层鱼类的放养指标提供一定的依据，还可用这些调查数据评述水体的污染程度。

一般情况下，底栖动物：指生活在水体底部，不能通过40目（每孔0.793mm）分样筛的大型无脊椎动物。 如环节动物水蚯蚓、软体动物螺蚌、节肢动物水生昆虫等。

三、实验器具与材料

彼德逊采泥器、样品瓶、脸盆、水桶、天平、显微镜、标签、白色解剖盘、酒精（95%、75%）、培养皿、铅笔、分样筛（40目）、小镊子、吸水纸等。

四、实验步骤

（一）采样

采样时，应事先记录当时的天气、气温、水温（表层、底层）、透明度、水深，然后进行采样，在记录底质及水生植物情况。采样时每个采样点上的大型和小型底栖动物各采2次样品。来不及分检的样品，应放入冰箱内保存，以免虫体腐烂不利于分析。

底泥中小型底栖动物：彼得逊采泥器采集。虾、蟹、螺、贝类采集：徒手或手抄网、铁铲、采泥器等工具在其生长地带进行采集。

彼得逊采泥器采得的泥样，先倒入40目/寸的铜丝分样筛中，然后将筛底放在水中轻轻摇荡，洗去样品中的污泥（若样品量大可分几次洗涤），最后将筛中的渣滓倒入所料袋中，并放入标签，将袋口缚紧带回实验室分检。这一过程也可将采的泥样倾入脸盆中，到岸边筛选，以免采样时间过长。

定量样品采完后，分别在各采样点上采一定数量泥样作定性标本用。

（二）样品保存

将上述采得的样品当场或带回室内进行分检。将洗净的渣滓倒入白色解剖盘内，加入清水，检出水蚯蚓和昆虫幼体，放入之广口瓶中固定保存。直至检完为止。标本需用小镊子、解剖针或习惯检选，柔软较小的动物也可用毛笔分检。此时，要避免损伤虫体。每一塑料袋的样品检完后，需将袋内的标签放进样品瓶内，并在每瓶外面贴上一个同样的标签。

检选出的底栖动物分别固定分装在样瓶中，水蚯蚓应先麻醉，使其舒展再固定，一般把水蚯蚓放在培养皿中，加少量水，然后每隔10分钟滴加95％酒精，直至虫体全部伸直。然后用4～10％甲醛液固定。

软体动物的螺蚌可保存于70～80％的酒精中，4～5天再换一次酒精即可。昆虫及甲壳动物，可放入小瓶中用50%酒精固定，再转入75％酒精固定。

（三）定性与定量

对采得的标本，必须进行正确的鉴定，分门别类，尽可能鉴定到种，然后分别计数和称重，底栖动物的生物量测定一般采用称重法和排水体积法。称重法较常用，称重前，先把样品放在吸水纸上，轻轻翻滚，以吸去体外附着水分，然后称其重量。大型种类应吸至吸水纸上没有潮斑为止，小型种类在滤纸上放约一分钟即可。大型双壳类称重前，应细心将贝壳分开，取出其内水分。软体动物可用托盘天平或盘秤称，蚯蚓和昆虫用扭力天平称，最后重量都换算成克。

鉴定计数，称重的数值需随时计入记录本中。最后，把所得的数据换算成一平方米面积上的个数（密度）和重量。可按下表（图12-1）记录采集、计数、称量、换算结果。

图12-1

 

版块三：水产增养殖学实践

模块	序号	课程名	实验项目/内容板块	学时	类型	能力目标
鱼类增养殖学	1	鱼类遗传育种学	鱼类染色体制备及核型分析	6	验证	掌握鱼类肾细胞染色体制备的方法和原理。通过鱼类染色体制备，并进行核型分析以此为鉴定其种质特征。通过对鱼类的染色体数量、核型进行研究，主要是探讨鱼类在细胞水平上的种质特性，为鱼类的种质鉴定、系统分类地位和细胞遗传学背景提供基础资料。
	2		鱼类三倍体的人工诱导	8	综合	了解人工诱导鱼类三倍体的原理、方法及其在水产动物育种上的意义。初步掌握鱼类三倍体的温度休克诱导方法。
	3		人工诱导鱼类四倍种育种	10	综合	了解人工诱导鱼类四倍体的原理、方法及其在水产动物育种上的意义。初步掌握鱼类四倍体的温度休克诱导方法。
	4	鱼类增养殖学	不同品系金鱼的杂交育种	8	综合	掌握杂交育种的基本原理与方法；掌握近亲繁殖与杂种优势，杂交亲本选择，杂交种的鉴定和观察，杂交育种的步骤，杂交育种的应用，远缘杂交及特点。
	5		亲鱼的催产与繁殖	10	综合	掌握常见增养殖鱼类亲鱼性腺成熟的检查方法，判断亲鱼卵巢发育时期。掌握常用催产剂种类选择、配制方法、剂量掌控、注射方法。

 

实验一 鱼类染色体制备及核型分析（6学时）

一、实验目的

1、掌握鱼类肾细胞染色体制备的方法和原理。

2、通过鱼类染色体制备，并进行核型分析以此为鉴定其种质特征。

3、通过对鱼类的染色体数量、核型进行研究，主要是探讨鱼类在细胞水平上的种质特性，为鱼类的种质鉴定、系统分类地位和细胞遗传学背景提供基础资料。

二、实验原理

染色体是主要的生物遗传物质载体，其染色体的数量、组型、形态都具有其特异性。研究鱼类的染色体，对于鱼类的遗传变异、分类地位、系统演化、性别决定、杂交育种等方面都具有重要的作用（楼允东， 1997）。鱼类染色体研究不仅能了解生物的遗传组成、进化地位及染色体演化过程，而且对鲤鱼种质鉴定和遗传育种等提供基础资料和科学依据。

鱼体内小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。如在体内注射植物血凝素（PHA），这种小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量有丝分裂中期细胞。

三、实验器具与材料

实验所用鱼为人工养殖的白乌鳢，来自于四川省内江市江龙水产公司白乌鳢人工养殖基地，健康状况良好，雌雄各6尾，体重70 ~100g，实验鱼运回实验室后在24℃水族箱中饲养至少24h后开始实验。

研钵、电子天平、4个1000mL容量瓶、2支10mL离心管、量筒、小烧杯、培养皿、培养箱、加热棒、镊子、眼科手术剪、1mL注射器、冰冻离心机、1.5mL离心管、CCD照相仪、长嘴吸管、显微镜、香柏油、二甲苯、载玻片2盒、5个载玻片盒。

四、实验试剂

1、生理盐水：称取8.5g NaCl固体溶于1000mL双蒸水中，摇匀，配制成浓度为0.85%的NaCl溶液。

2、低渗溶液: 称取2.794g KCl固体溶于1000mL双蒸水中，摇匀，配制成浓度为0.0375mol/L的KCl溶液。

3、植物血凝素（PHA）溶液：称取0.007g PHA粉末溶于10mL双蒸水中，摇匀配制成浓度为0.07%的PHA溶液于4℃冰箱中保存。

4、磷酸缓冲液（PBS, pH=7.3）：甲液，称取1.56g NaH2PO4·2H2O溶于1000mL蒸馏水中，摇匀；乙液，称取3.58g K2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中，摇匀；将甲乙3:7比例混合。

5、Giemsa母液：称取0.5g Giemsa粉，甘油33mL，先倒少许甘油在研钵中，将Giemsa研至无颗粒后，将剩余的甘油倒入研钵中，60℃下存放1.5h后加入33mL甲醇，保存于棕色试剂瓶中（保存时间越长染色效果越好）。

6、卡诺固定液：将甲醇与冰乙酸按3:1的比例混合，现配现用。

7、秋水仙素溶液：称取0.03 g秋水仙素粉末溶于100mL双蒸水中，摇匀配制成浓度为0.03%的秋水仙素溶液4℃冰箱中保存。

五、实验步骤

1、PHA和秋水仙素处理

按10μg/g鱼体重向鱼体腹腔注射PHA溶液，6h后再向鱼体腹腔注射与第一次相同剂量PHA溶液，在25℃水箱中饲养12h后按5μg/g鱼体重注射秋水仙素溶液，在25℃水族箱中饲养2.5h。

2、取材

预期处理后将实验鱼断头放血5min，放血后取鱼肾脏于0.85%的生理盐水中洗涤去结缔组织后放于2mL离心管内用眼科手术剪尽量将组织块剪碎。剪碎后用长嘴吸管吹打数次使细胞分散，吹打时力度不可过大以免将细胞悬液溢出。吹打结束后静置5min使组织块沉淀，吸取细胞悬液于另一干净离心管中，60000r/min离心15min。

3、低渗

弃上清液，加入适量0.5% KCl / 0.075mol/L KCl溶液(预热37℃的低渗液)，用手轻轻击打离心管底部，利用回旋力将细胞打散，力度要轻以免细胞破裂。击打均匀后将其放入37℃烘箱中低渗处理120min，期间，反复吹打多次。低渗结束后，60000 r/min离心20min。

4、固定

弃上清液，收集细胞加少许新配置的卡诺固定液，将细胞击打散后再加入适量卡诺固定液，固定30min，固定结束后60000 r/min离心15min。重复固定3次。

5、制片染色

弃上清液，加入新配制的卡诺固定液8滴，将细胞击打均匀。冰冻玻片倾斜45°放置，在距离玻片高50cm左右滴片，每片滴2～3滴，不能重叠滴加，空气自然干燥。干燥后将磷酸缓冲液（pH=7.3）与Giemsa母液按9:1混合制成染液（现配现用），每片玻片滴加数滴染液，染色30min。染色后用自来水冲洗（冲洗玻片背面），自然干燥后观察。

6、染色体观察

在油镜下选取来自同一地区不同个体的50~100个分散良好，形态清晰，数目完整的中期分裂相，用Optimas软件系统手工统计每个分裂相的染色体数目，并进行显微摄影。找出染色体数目的众数，即为该地区白乌鳢染色体的倍性。

六、作业

1、染色体数目统计，通过对至少10个分裂相较好的细胞进行统计，确定白乌鳢的染色体众数是多少？

2、核型分析，选取到至少5个中期分裂相良好，形态清晰的染色体组进行核型分析，通过测量、计算染色体的相对长度及臂比，统计白乌鳢的核型及染色体臂数？

3、请查阅文献资料，将白乌鳢的核型与其他鳢科鱼类的染色体核型进行比较，以此来确定白乌鳢的种质特征，并讨论鳢科鱼类之间的进化关系？

实验二 鱼类三倍体的人工诱导（8学时）

一、实验目的

1、本实验主要目的是了解人工诱导鱼类三倍体的原理、方法及其在水产动物育种上的意义。

2、初步掌握鱼类三倍体的温度休克诱导方法。

二、实验原理

含有3组染色体的细胞或生物称为三倍体生物。三倍体生物因难以进行减数分裂形成配子，故常不育。人工三倍体的诱导通过保留受精卵第二极体来实现，鱼卵成熟排出体外，精子进入鱼卵，卵子正处于第二次减数分裂的中期，精子入卵数分钟后即放出第二极体。通过物理或化学方法抑制第二极体的外排，受精卵中就保留了两套雌核的染色体和一套雄核的染色体而成为三倍体。三倍体鱼类的诱导主要包括温度处理（热休克和冷休克）、静水压处理和化学药物处理等。

三倍体鱼因染色体组成不平衡，性腺不能发育成熟，用于性腺发育的能量可全部用于生长，避免了性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降，也避免了性腺发育时期的生长停滞和死亡率上升，且外来种不会与本地种杂交，可防止种质混杂，因此人工诱导的三倍体鱼具有不育、个体大、生长快、寿命长、肉质好、成活率高等优良品性，对提高养殖产量和鱼肉品质具有重要的意义。

鱼类三倍体由于其具有不育性，利用其这一特点可以控制鱼类的过度繁殖和防止其对生态环境的破坏。如三倍体的草鱼是不育的，但是它可以控制水中的杂草，又不会造成因为草鱼过多而破坏生态。这一实例可以很好地解决美国等很多国家面临的难题。三倍体鱼类鱼肉的成分与二倍体也是有区别的，张涌泉研究三倍体虹鳟的形质，发现三倍体比二倍体的脂质含量高出许多；程献等发现湘云鲤胴体比普通锦鲤厚1/3左右，湘云鲤具有肉质鲜美、胴体厚、个体大、细刺少等优点。

三、实验器具与材料

性成熟的二倍体乌鳢亲鱼（雌、雄）。纯水系统和超纯水系统（MILL-Q，Millipore）、显微成像系统（Imager Z2，Zeiss）、Motic数码显微镜（BA300，美国）、HHS-2型电热恒温水浴锅、孵化系统、水族箱、电子秤等。

四、实验试剂

1、一次性注射器、生理盐水、促黄体素释放激素类似物（LRH-A2）、抗凝血剂柠檬酸钠等。

2、抗凝血剂柠檬酸钠：柠檬酸钠0.8g，氯化钠0.42g，葡糖糖2.05g，溶解于100 mL蒸馏水中。

3、15%Giemsa染料：称取吉姆萨粉剂0.8g溶于50 mL甲醇中，在研钵中充分研磨，溶解后再加50 mL甘油，混合摇匀，置于37~40℃温箱中8~12h，用有色玻璃瓶密封保存备用。

五、实验步骤

1、亲鱼来源和精卵收集

实验用乌鳢亲鱼来源于内江市江龙水产养殖专业合作社养殖的2龄以上、体质健壮、无伤病的个体。实验在内江师范学院“长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室”实验基地进行。乌鳢亲鱼用促黄体素释放激素类似物（LRH-A2）直接进行人工催产，催产药物剂量为10μg/kg，一次注射，到达效应时间（30～36h）后，人工挤卵并均分成若干等份待用。雄性亲鱼按5μg/kg剂量注射LHRH-A2进行催产。达到效应时间后，杀乌鳢雄鱼取精巢，用剪刀剪碎，加入5倍体积的保存液混匀后置于4℃冰箱中待用。

2、三倍体诱导

（1）热休克处理最佳起始时间的筛选

根据前期预实验，确定受精卵分别于授精后3min、4min、5min和6min置于40～42℃的精密恒温水浴箱中进行热休克处理，持续处理2～3min后将受精卵移入（28±0.5 ℃）水温中进行孵化(表Ⅱ­2­1)。正常乌鳢精卵授精后，不进行热休克处理作为对照组。孵化期间，分别统计实验组及对照组的受精率（发育至原肠中期的胚胎卵数占总卵的百分比））和孵化率（孵出鱼苗数占受精卵的百分比），仔鱼孵出后统计三倍体率，从而筛选出最佳热休克处理起始时间。每组实验进行3次以上重复。运用Excel和SPSS13.0软件对数据进行统计分析。

（2）热休克处理温度和持续处理时间的筛选

得出热休克处理最佳起始时间后，设置热休克处理温度分别为38℃、40℃、42℃和44℃共4个实验组和1个对照组(表Ⅱ­2­2)。实验时将受精卵分别置于上述水温的精密恒温水浴箱中进行热休克处理2～3min，处理完毕后将受精卵移入（28 ±0.5 ℃）水温中进行孵化，分别统计不同处理组的受精率、孵化率和三倍体率，从而确定最佳的处理温度。

最后根据上述两个实验结果筛选持续处理时间，设置持续处理时间分别为1min、2min、3min和4min共4个实验组和1个对照组（表Ⅱ­2­3）。处理完毕后将卵移入28±0.5 ℃水温中进行孵化。统计各组的受精率、孵化率和三倍体率，从而确定最佳的处理持续时间。

3、倍性鉴定

（1）染色体计数

以人诱导的三倍体鱼苗和对照组鱼苗为对象，待鱼苗长至20～30cm时，各实验组随机取10尾，剪尾鳍进行尾鳍细胞的培养，培养方法参照曾令兵等的方法。将传至第2代的尾鳍细胞传代培养，24h后更换新鲜培养基，添加终质量浓度为1μg/mL的秋水仙素处理，培养13～15h。吸出培养液，胰酶-EDTA消化分散细胞，离心收集细胞，参照Wang等和Lu等的方法进行染色体制片，高倍显微镜下观察计数尾鳍细胞的染色体数目。

（2）DNA相对含量测定

分别收集各实验组孵化出膜后的鱼苗10尾，捣碎、用300目筛绢过滤，用PBS（pH=7.4）调成细胞数为106个/mL的细胞悬液，NIM-DAPI染色1min。用流式细胞仪（Beckman Coulter，Cytoflex，USA )进行DNA含量分析。采用正常二倍体鱼苗作对照进行检测。三倍体率=三倍体检出个体数/总检测个体×100%。

（3）红细胞（核）大小比较

每个实验组随机选取1月龄幼鱼10～20尾，用经1％肝素钠浸润过的1 mL注射器从鱼尾部静脉抽血，涂片后用甲醇固定，在空气中干燥后用Wright-Giemsa混合染液染色5min，室温干燥。在显微镜下分别测量红细胞与红细胞核的长径和短径，根据公式：S=πab/4，V=a2b/1.91，核质比=红细胞核/红细胞质，分别计算红细胞与红细胞核的面积、体积和核质比。式中，a、b分别为短径和长径。每个样本各测100个细胞，求其平均值。

4、二倍体、三倍体乌鳢鱼苗生长比较

二倍体对照组鱼苗和三倍体乌鳢鱼苗的生长对比实验在“长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室”的实验养殖基地完成。实验所用三倍体鱼苗均为经倍性鉴定后的体格健壮、无伤病的鱼苗，鱼苗均在水泥培育池中采用静水养殖，气泵增氧。鱼种培育池面积为10m2，水深0.8m，每池放实验鱼250尾，鱼苗放养密度为25尾/m2。每天投喂2次，即8：00～9：00、16：00～17：00 各投喂1次，日投饲量为池内乌鳢总质量的5%～8%。实验设置3个重复。二倍体对照组和三倍体群体分别在4月龄和8月龄釆样，测其体长、体重，每个群体分别测50尾。实验结束后统计各个实验组的存活率。采用SPSS 130 软件进行单因素方差分析(ANOVA)，以Duncan 法进行多重比较。

六、作业

1、如何来确定热休克处理的最佳起始时间？请根据实验结果依次统计各组的受精率、孵化率和三倍体率，并填写完成表Ⅱ­2­1。

表­1不同热休克处理起始时间对乌鳢三倍体诱导效果的影响

Table 1 Effects of different initiation time after fertiliziation of heat shock on induction rate of triploid inChannaargus

组别	热休克起始时间min Initiation time of heat shock	受精率 Fertilization rate %	孵化率 Hatchingrate%	三倍体率 Percentage of triploid%
对照组
A1
A2
A3
A4

2、如何来确定热休克处理的最佳温度与持续时间？并完成不同热休克处理温度对乌鳢三倍体诱导效果的影响统计。

表­2不同热休克处理温度对乌鳢三倍体诱导效果的影响

Table2 Effects of different heat shock treatment temperature on induction of triploid inChannaargus

组别 Group	热休克处理温度℃ Heat shock treatment temperature	受精率Fertilization rate %	孵化率 Hatching rate%	三倍体率Percentage of triploid%
对照组Control
B1
B2
B3
B4

3、请完成表Ⅱ­2­3不同热休克持续时间对乌鳢三倍体诱导效果影响的统计分析。

表­3不同热休克持续时间对乌鳢三倍体诱导效果的影响

Table ­3 Effects of different heat shock duration on the induction of Triploid inChanna 4.argus

组别 Group	热休克持续时间min Heat shock duration	受精率Fertilization rate%	孵化率 Hatching rate %	三倍体率 Percentage of triploid%
对照组Control
C1
C2
C3
C4

4、查阅相关文献，讨论分析多倍体的鉴定方法有哪些。

5、分组讨论三倍体鱼类具有怎样的生物学特性。

6、简述人工诱导鱼类三倍体的原理、方法及意义。

7、查阅相关资料，试运用该原理设计如何培育三倍体稀有鱼句鲫，用示意图描述操作步骤。

 

实验三 人工诱导鱼类四倍种育种（10学时）

一、实验目的

1、了解人工诱导鱼类四倍体的原理、方法及其在水产动物育种上的意义。

2、初步掌握鱼类四倍体的温度休克诱导方法。

二、实验原理

抑制受精卵第一次卵裂诱导四倍体的原理。卵子受精后，照常排出第二极体形成单倍体卵，单倍的卵原核与单倍的精原核结合就形成二倍的受精卵，这时再抑制受精卵的第一次卵裂，则产生四倍体。抑制受精卵第一次卵裂的原理是使染色单体分离而细胞质或细胞核不分裂，从而导致细胞内染色体含量加倍产生四倍体。

三、实验器具与材料

成熟的二倍体白乌鳢（雌、雄）。3台数码恒温水浴锅、玻璃培养皿、保鲜袋、移液器、显微镜、载玻片、一次性注射器（1 mL）、计时器、不锈钢带孔漏筛（5个）、毛巾

四、实验试剂

HGC 、LRH -A2、

五、实验步骤

1、白乌鳢亲鱼鉴定

雄鱼身体狭长，腹部扁平；雌鱼身体宽阔，腹部饱满。在繁殖季节，雄鱼鳃盖、胸鳍上有白色颗粒状追星，体表粗糙，挤压腹部有精液流出。雌鱼泄殖孔较突出、红肿，挤压腹部有卵粒流出。雌雄比例为白乌鳢雄鱼少，雌鱼比例略高些。

2、人工催产

采用胸鳍皮下注射法，用LHRH-A2+HCG+DOM混合注射，注射量为雌鲫每尾0.1ml，雄鲫剂量减半。注射催产剂后10-15小时，检查雌鲫，轻压腹部，如有卵粒呈线状流出，比例达到70%以上，即可进行人工授精。因雄鲫精巢发育同步性差，往往很难挤出足量的精液，因此须杀雄取精。

3、受精及孵化

人工授精前，准备准备好授精所需的器具（如剪刀、抹布、碾钵等）。先把授精用的工具清洗干净，放在阴凉处凉干。授精操作在室内进行，以免阳光杀伤卵子和精子。将成熟度良好的二、四倍体雌鱼的卵挤入培养皿中。杀死雄鲫，取出精巢，擦净血迹后，细细，并用林格氏液稀释，一尾雄白乌鳢的精巢可加入50毫克林格氏液。随后按如下方式进行受精：2n♀×2n♂立即用羽毛搅拌，待充分受精后，撒在网片上，放入孵化缸内进行流水孵化。

4、四倍体诱导

（1）热休克处理适宜温度的筛选

根据白乌鳢人工诱导三倍体以及预实验得出的数据，确定设置本次实验的处理适宜温度为40℃±0.5℃，进行最佳的处理起始时间和处理持续时间的探究。

（2）热休克处理起始时间和处理持续时间受精后5min，倾去培养皿中的水，将其迅速置于0～3℃的冰水中，严格控制温度。处理30min后取出。置于曝气的水中室温孵化。

5、数据统计

孵化过程中经常更换曝气的水，保持室内空气新鲜和流通。另外，及时用吸管吸出死亡的胚胎并计数。待发育到原肠期时统计受精率，受精率=受精卵数/总卵数×100%。2d后把孵化的仔鱼用移液管移到另一个培养皿中，同时用计数器计数。孵化率=孵化数/受精总卵数×100%。

六、作业

1、简述四倍体鱼类的生物学特性及人工诱导四倍体的原理，并试运用该原理设计如何培育四倍体鲤鱼，用示意图描述操作步骤。

2、试设计如何运用多倍体育种技术培育四倍体草鱼？并用示意图描述操作步骤。

3、请提供各小组的白乌鳢四倍体鱼外周血血涂片的红细胞和红细胞核大小鉴定图片。

4、热休克法诱导白乌鳢四倍体的适宜处理时间的筛选结果？

5、鱼类四倍体诱导时关键要掌握那几点？

 

实验四 不同品系金鱼的杂交育种 （8学时）

一、实验目的

1、掌握杂交育种的基本原理与方法；

2、掌握近亲繁殖与杂种优势，杂交亲本选择，杂交种的鉴定和观察，杂交育种的步骤，杂交育种的应用，远缘杂交及特点。

二、实验原理

通过人工杂交将两个或多个品种的优良性状综合在一起，培育出生物新品种或新类型的方法。目的是利用杂种优势，以获得在生长速度、繁殖率、抗病力、抗逆性、品质等生产性状方面比亲本更优的养殖新品种。

三、实验器具与材料

一次性注射器（1mL）、毛巾、孵化鱼缸。红白虎头和红白蝶尾雌雄亲鱼若干（或红琉金金鱼与红龙睛金鱼，具体由客观情况灵活掌握），催产激素若干。

四、实验步骤

1、亲鱼品种选择：红白虎头和红白蝶尾雌雄个体各选取30尾，均选取45～50g的白色占1/2左右的个体。

2、亲鱼购买与配组：挑选形态特征明显，成熟度好的健康亲鱼，放入水泥繁殖池中(5m×3m×0.3m)。

3、亲鱼繁殖（人工授精）与胚胎发育：将追逐的金鱼打捞起来进行一对一人工湿法授精，授精完成后放入对应的鱼缸自然孵化，每个鱼缸只放入一对鱼的受精卵，每个组合3个重复。

4、鱼苗饲养与管理：平游鱼苗陆续出现后，开始投喂蛋黄水，1周后投喂活的鱼虫至40日龄。后开始投喂蛋白质含量为40%的饲料，每15d观察一次鱼苗的颜色变化。

5、体色类型划分与数据处理：开始时的鱼苗体色都为青灰色，随生长过程，鱼苗的颜色会逐步出现分离。统计分离的颜色类型，用方差分析数据，讨论结果。

五、作业

1、简述金鱼杂交育种方案的具体步骤。

2、观察并记录鱼苗生长过程中体色变化的对应时间及颜色类型，分析颜色和生长数据，最后分析和讨论实验结果。

 

实验五 亲鱼的催产与繁殖（10学时）

一、实验目的

1、掌握常见增养殖鱼类亲鱼性腺成熟的检查方法，判断亲鱼卵巢发育时期。

2、掌握常用催产剂种类选择、配制方法、剂量掌控、注射方法。

二、实验原理

常见催产剂的种类及作用机理：目前我国广泛使用的催产剂主要有三种，即鱼类脑垂体(简称重体或PG)，绒毛膜促性腺激素(简称绒膜激素或HCG)，促黄体生成素释放激素类似物(简称类似物或LRH-A)，此外，还有一些提高催产效果的辅助剂，如多巴胺排除剂(RES)、多巴胺拮抗物(DOM)。

1、脑垂体(PG)一般为自制，多用鲤鱼脑垂体。其作用机理是利用性成熟鱼类脑垂体中含有的促性腺激素，主要为促黄体素(LH)和促滤泡激素(FSH)。将它的悬浊液注入鱼体后，其中的滤泡激素可促使精卵进一步发育成熟，促黄体素进一步促使鱼发情产卵。用脑垂体催产有显著的催熟作用。在水温较低的催产早期，或亲鱼一年催产两次时，催产效果比绒毛膜促性腺激素好，但若使用不当常易出现难产。

2、绒毛膜促性腺激素(HCG)一般为市售成品，商品名称为"鱼用(或兽用)促性腺激素"。为白色、灰白色或淡黄色粉末，易溶于水，遇热易失活，使用时现配现用。它是从孕妇尿中提取的，主要成份是促黄体激素(LH)，主要作用是促进亲鱼排卵，也有一定的促性腺发育作用。

3、促黄体生成素释放激素类似物(LRH-A)为市售成品，是人工合成的，目前市售的商品名称叫"鱼用促排卵素2号"(LRH-A)和"鱼用促排卵素3号"(LRH-A3)。为白色粉末，易溶于水，阳光直射会使其变性。它不象垂体和绒毛膜激素那样直接作用于性腺，而是作用于鱼类脑垂体使其分泌促性腺激素，进一步促使卵母细胞发育成熟并排卵。

三、实验器具与材料

鲟鱼、鲢鱼、草鱼。柔软毛巾，取卵器、烧杯、量筒、注射水、注射器、酒精、鱼类催产药物。产卵池、孵化池、孵化桶、集苗池。

四、实验步骤

1、检查亲鱼性腺发育的成熟度

（1）把亲鱼腹部向上翻，用毛巾盖住亲鱼眼睛，肉眼检查雌性亲鱼的腹部膨胀情况，再用取卵器从雌性亲鱼的生殖孔插入腹部两侧取出一小点卵粒放在有酒精的烧杯中检查。如果卵粒成圆形并用取卵器搅动后就散开，则卵粒成熟度高。如果用取卵器搅动后卵粒不分开，则卵粒成熟度不够。

（2）雄鱼则用手指沿腹部两侧从胸部往肛门方向用力挤压，如果有白色精液流出且在水中能快速分散，则为成熟雄鱼。如果没有精液流出或者流出极少，且在水中不易扩散， 则雄鱼成熟度不足。

2、挑选成熟的雌雄鱼进行催产

（1）通常雌雄鱼的比例为1：1.5

（2）把成熟的亲鱼运至产卵池的网箱中备产

3、催产剂的配置

（1）用注射水配置催产剂，药品包括绒毛膜促性腺激素（HCG）、促黄体素释放激素及类似物（LPH-A）、脑垂体、地欧酮（DOM）。按照不同的品种和不同的成熟度配置催产剂。

（2）鳙鱼、鲢鱼催产剂种类及注射量（按每千克体重计算）：LRH-A10ug或者HCG1400

（3）2000IU，一般配置每尾鱼2～4毫升。

4、药剂注射

（1）通常在胸鳍基部无鳞片处注射，注射深度2～3公分，一般为同边注射。雌性亲鱼注射分两次，第一次注射总剂量的30％－35％，第二次注射总量的65％－70%，两针相隔时间7～8小时。

（2）雄性亲鱼为一次注射，注射量为雌性亲鱼注射量的一般。在雌性亲鱼第二次注射时同时注射雄性亲鱼。

5、水流冲击

雌性亲鱼第二次注射后要在产卵池里注水，使产卵池里的水流速每秒1～1.2米。

6、自然受精和人工受精

（1）自然受精：雌性亲鱼注射第二针后4小时鱼类开始发情，注意观察，若发现雌雄鱼追逐比较激烈，且身体浮上水面并紧贴一起剧烈颤动，则开启集卵管的开关，让卵子留如孵化池。

（2）人工受精：在雌雄鱼追逐比较激烈，但身体没有浮出水面紧贴在一起之前，下网捞起准备即产卵的亲鱼用毛巾包住，用手将雌性亲鱼的卵子挤压至盆里，同时快速挤压雄性亲鱼使其精液射出至盆里，加入少量生理盐水后用搅拌棒轻轻搅动，使卵子充分受精。在搅拌约3至5分钟后，把受精卵放如孵化池孵化。

7、孵化池的管理

孵化池需要有专人值班，水流速度为每秒1～1.2米，若孵化池里有杂物和敌害需要及时清除。在水花出没时要经常清洗过滤网，保持水流畅通。在鱼花长出腰点后既可出池销售或者下塘培育。

五、作业

1、简述亲鱼挑选的过程。

2、简述亲鱼催产过程。

 

版块四：水产动物饲料加工与品控实践

模块	序号	课程名	实验项目/内容板块	学时	类型	能力目标
动物营养与饲料	1	水产动物营养与饲料学	自制配合饲料原料的采购	3	综合	使学生了解原料市场；熟悉原料生产企业；熟悉原料的价格。
	2		自制配合饲料水分的测定	6	设计	使学生掌握饲料水分测定的方法和判别标准；培养其鉴别饲料质量的能力。
	3		自制配合饲料粗蛋白的测定	6	设计	掌握饲料粗蛋白质含量的测定方法，并测定各种样本的粗蛋白质含量。
	4		自制配合饲料粗脂肪的测定	6	设计	使学生掌握饲料及畜体、畜产品及粪中粗脂肪的测定方法，使其能够根据粗脂肪含量，判别饲料质量。
	5		自制配合饲料粗灰分的测定	6	设计	使学生掌握饲料中粗灰分（矿物质）测定法，使其能够根据粗灰分含量，判别饲料质量。
	6		自制配合饲料中钙的测定	6	设计	使学生掌握应用高锰酸钾法测定饲料中钙含量的方法
	7		自制配合饲料中磷的测定	6	设计	使学生掌握应用比色法测定饲料中磷含量法
	8	水产饲料品控与加工工艺实训	饲料和原料的采样、制样、登记与保管	3	综合	培养学生为选择原料、供应商、接收或拒绝某种饲料原料的能力；提高学生判断产品质量，饲料加工程度和生产工艺质量控制的能力。
	9		自购原料的容重测定	3	设计	使学生掌握容重测定的方法，培养其通过容重判断饲料的质量的能力。
	10		自购原料的鉴别（显微镜检技术）	3	设计	使学生掌握显微镜检测饲料及原料的方法、原理；能独立操作并判断各种饲料及原料结构特征。
	11		自购原料粉碎细度的测定	3	设计	使学生掌握饲料粉碎细度的测定方法，培养其判断原料粉碎是否合格的能力。
	12		自购原料混合均匀度的测定	3	设计	使学生掌握饲料混合均匀度测定的方法，培养其判断原料混合是否合格的能力。
	13		自制颗粒饲料含粉率和粉化率的测定	3	设计	使学生掌握筛分法测定颗粒饲料含粉率和回转箱法测定颗粒饲料粉化率的方法，培养其评价所测颗粒饲料含粉率与粉化率是否合格的能力。
	14		自制颗粒饲料硬度的测定	3	设计	使学生掌握饲料颗粒硬度测定的方法；培养其根据饲料颗粒硬度判断饲料是否合格的能力。

 

实验一、自制配合饲料原料的采购（3学时）

一、实验目的

1.   了解原料市场；

2.   熟悉原料生产企业；

3.  熟悉原料的价格。

二、实验原理

   饲料原料是配合饲料的物质组成部分。

三、实验器具与材料

    电话机、电脑、交通工具。

四、实验步骤

1.   查阅资料获得所分配的原料的产地、一般品质、加工工艺、价格范围等信息；

2.   查找资料找到此种原料的生产企业；

3.   通过电话、网络等通讯方式联系原料生产企业；

4.   向企业询问其生产的此原料的产地、加工工艺、有效成分含量、价格（每个原料需询三家企业）；

5.   向企业索要此种原料的样品和网购；

6.   填写索样和网购样品记录表。

五、作业

采购分配的饲料原料，填写索样和网购样品记录表。

实验二、饲料和原料的采样、制样、登记与保管（3学时）

一、实验目的

1)   为饲料配方选择原料、选择原料供应商、接收或拒绝某种饲料原料；

2)   判断产品的质量是否符合规格要求和保证值，仲裁买卖双方的争议；

3)   判断饲料加工程度和生产工艺控制质量；

4)   分析保管贮存条件对原料和产品质量的影响程度；

5)   保留每一批饲料原料或产品的样品，以备急需时用；

二、实验原理

1)   样品必须具有代表性、必须采用正确的采样方法、样品必须有一定的数量

2)   采样人员应有高度责任心和熟练的采样技能

3)   重视和加强管理

三、实验器具与材料

探针采样器、锥形袋式取样器、液体采样器（1）空心探针（2）炸弹式或区层式采样器、自动采样器、剪刀（或切草机）、刀、铲、短柄或长柄勺等也是常用的采样工具；

四、实验步骤

1、采样的步骤

（1）采样前记录：采样前，必须记录与原料或产品相关的资料，如生产厂家、生产日期、批号、种类、总量、包装堆积形式、运输情况、贮存条件和时间、有关单据和证明、包装是否完整、有无变形、破损、霉变等。

（2）原始样品采集：也叫初级样品，是从生产现场如田间、牧地、仓库、青贮窖、实验场等的一批受检的饲料或原料中最初采取的样品。原始样品应尽量从大批（或大数量）饲料或大面积牧地上，按照不同的部位即深度和广度来分别采取一部分，然后混合而成。原始样品一般不得少于2Kg。

（3）次级样品：也叫平均样品，是将原始样品混合均匀或简单的剪碎混匀，从中取出的样品。平均样品一般不少于1Kg。

（4）分析样品：也叫实验样品。次级样品经过粉碎、混匀等制备处理后，从中取出的一部分即为分析样品。分析样品的数量根据分析指标和测定方法要求而定。

2、样品的制备

风干样品的制备

1)   原始样品的采集。按照几何法和四分法采集。

2)   次级样品的采集。对不均匀的原始样品如干草、秸秆等，可经过一定处理如剪碎或锤碎等混匀，按四分法采取次级样品。对均匀的样品如玉米、粉料等，可直接按四分法采取次级样品。

3)   分析样品的制备

（1）制备设备：常用样品制备的粉碎设备有植物样本粉碎机、旋风磨、咖啡磨和滚筒式样品粉碎机。其中最常用的有植物样本粉碎机、旋风磨。植物样本粉碎机易清洗，不会过热及使水分发生明显变化，能使样品经研磨后完全通过适当筛孔的筛。旋风磨粉碎效率高，但在粉碎过程中水分有损失，需注意校正。

（2）制备过程：次级样品用饲料样品粉碎机粉碎，通过孔径为1.00～0.25mm孔筛即得分析样品。主要分析指标样品粉碎粒度要求见表3。注意：不易粉碎的粗饲料如秸秆渣等在粉碎机中会剩留极少量难以通过筛孔，这部分决不可抛弃，应尽力弄碎如用剪刀仔细剪碎后一并均匀混入样品中，避免引起分析误差。将剪碎完毕的样品200～300g装入磨口广口瓶中，贴好标签放入避光、阴凉、干燥处备用。标签上应注明样品名称、采集地点、采集时间、采样人以及必要的若干说明，以便对照核查。

半干样品的制备

1)   半干样品是由新鲜的青饲料、青贮饲料等制备而成。这些新鲜样品含水量高，占样品质量的70%～90%，不易粉碎和保存。除少数指标如胡萝卜素的测定可直接使用新鲜样品外，一般在测定饲料的初水分后制成半干样品，以便保存，供其余指标分析备用。的样品称为新鲜样品。例如：青草、多汁饲料、青贮饲料、鲜肉、鲜乳、粪便等。

2)   初水分是指新鲜样品在60～65℃恒温干燥箱中烘8～12h，除去部分水分，然后回潮使其与周围环境条件的空气湿度保持平衡，在这种条件下所失去的水分称为初水分。去掉初水分之后的样品为半干样品。

3)   半干样品的制备包括烘干、回潮和称恒重3个过程。最后，半干样品经粉碎机磨细，通过1.00～0.25mm孔筛，即得分析样品。将分析样品装入磨口广口瓶中，贴好标签放入避光、阴凉、干燥处备用。标签上应注明样品名称、采集地点、采集时间、采样人以及必要的若干说明，以便对照核查。

3、样本的登记

样本登记内容如下：

1)   样本名称（一般名称、学名和俗名）和种类（必要时要注明品种、质量等级）。

2)   生长期（成熟程度）、收获期和茬次。

3)   调制和加工方法即贮存条件。

4)   外观形状及混杂度。

5)   采样地点和采集部位。

6)   生产厂家和出厂日期。

7)   重量。

8)   采样人和分析人姓名。

4、样品的保管

1)   保存条件。样品应避光保存，并尽可能低温保存，并做好防虫措施。

2)   保存时间。样本保存时间的长短应有严格规定，这主要取决于原料更换的快慢及买卖双方谈判情况（如水分含量过高，蛋白质不足是否合乎规定）。此外，对某些饲料在饲喂后能出现问题，故该饲料样本应长期保存，备作考验。专门从事饲料质量检验监督机构的样品保存期一般为3～6个月。

五、作业

1.   简述四分法采样的步骤

2.   简述采样的意义

实验三、自购原料的容重测定（3学时）

一、实验目的

测定饲料颗粒的容重，使学生掌握容重测定的方法，判断饲料的质量。

二、实验原理

容重是指饲料颗粒在单位容积内的质量，单位：g/L。

三、实验器具和材料

平盘、料铲、容重器、电子称。

四、实验步骤

1.   采样与制备

2.   容重器安装及测定

1)   打开箱盖，取出所有部件，按样品颗粒选好漏斗，关闭漏斗口。

2)   将排气砣和容量筒放在电子秤上，调零。

3)   取下容量筒，将容量筒安装在铁板底座上，将插片准确地插入豁口槽中，放上排气砣，套上中间筒和谷物筒。

4)   将制备好的试样倒入谷物筒内，装满刮平；打开漏斗开关，让样品自由下落进中间筒，待试样全部进入中间筒后，关闭漏斗开关。

5)   用手握住谷物筒与中间筒的连接处，迅速抽出插片，此时样品和排气砣同时落入容量筒。

6)   插上插片，依次取下谷物筒、中间筒和倒净插片上多余的试样；取下容量筒上的铁板底座，抽出插片，将容量筒放在电子秤上称量。

7)   两次测定结果的允许差不超过3g/L，求其平均数，即为测定结果。测定结果取整数。

五、作业

1.   简述玉米容重测定的完整步骤

2.   简述饲料容重测定的意义

实验四、自购原料的鉴别（显微镜检技术）（3学时）

一、实验目的

1.   掌握显微镜检测饲料及原料的方法、原理；

2.   能独立操作并判断各种饲料及原料结构特征。

二、实验原理：

显微镜检测是指利用立体(体视)显微镜观察饲料之外观，组成或细胞形态、色泽、颗粒大小、软硬度，构造与嗅味，及其不同的染色特性等，或用生物显微镜（高倍：100～200 倍）

观察细胞及组织结构，并以化学或其他分析方法（定性、定量），鉴定饲料原料之种类及异物之方法。是一种省钱和最快速的质量监督方法。

三、实验器具和材料

显微镜、培养皿、四氯化碳、丙酮等

四、实验步骤

五、作业

1.   描述镜检下鱼粉、水解羽毛粉的区别

2.   简述镜检下豆粕、米糠、棉籽饼、油枯的特征

实验五、饲料粉碎细度的测定（3学时）

一、实验目的

    测定原料粉碎粒度，使学生掌握饲料粉碎细度的测定方法

二、实验原理

    用规定的标准试样筛在振筛机上和人工对试料进行筛分，测定各层筛上留存物料的质量，计算占总样品质量的百分比。

三、实验器具和材料

标准筛、振筛机、电子秤、计算器

四、实验步骤如下：

1、检查实验设备是否齐备，并将标准筛从大到小（底筛在最下面）自上而下安装在振筛机上；

2、检查振筛机运行是否正常；

3、将待测定的样品用四分法称取100克试样；

4、将试样小心放入标准筛的最上层筛面上，盖上筛盖确保密封；

5、开动振筛机电机，连续筛理10min；

6、筛理完毕后，将各层筛上留存物分别称重，记录各层筛上物的重量；

7、计算：本测定方法是分别算出4、6、8、12、16目筛筛上物的留存百分率，以此来描述物料的粒度。计算公式如下：筛上物留存百分率（％）= 该层筛上午重量/试样总重量×100%

五、作业

1.   简述饲料粉碎细度的测定方法

2.   简述饲料粉碎细度测定的意义

实验六、饲料混合均匀度的测定（3学时）

一、实验目的

测定饲料原料粉碎后混合均匀度，是学生掌握饲料混合均匀度测定的方法；

二、实验原理

本法以甲基紫色素作为示踪物，将其与添加剂一起加入，预先混合于饲料中，然后以比色法测定样品中甲基紫含量，以饲料中甲基紫含量的差异来反映饲料的混合均匀度，本法主要是适用于混合机和饲料加工工艺中混合均匀度的测试。

三、实验器具和材料

分光光度计、标准筛、甲基紫（生物染色剂）、无水乙醇（分析纯）等

四、实验步骤

称取试样10克（准确至0。0002克），放在100 ml的小烧杯中，加入30 ml无水乙醇，不时地加以搅拌，烧杯上盖一表面皿玻璃，30分钟后用滤纸过滤（定性滤纸，中速），以无水乙醇作空白调节零点。用分光光度计，以5m m比色皿在590nm的波长下测定滤液的吸光度。

     以各次测定的吸光度值为X1、X2、X3。。。。。。X10，其平均值X，标准差S与变异系数CV按下式计算

               变异系数CV（%）=S/ X×100

              

 式中：S=      X12+X22+X32+。。。+X102—10 X2

                        10—1

X1，X2，X3。。。、X10——10个试样的测定值（吸光度）；

X—试样吸光度的平均值；

S—试样吸光度的标准差。

五、作业

1.   简述测定饲料原料混合均匀度的方法；

2.   简述饲料原料混合均匀度测定意义

实验七、自制颗粒饲料含粉率和粉化率的测定（3学时）

一、实验目的

    测定配合饲料的含粉率和粉化率；使学生掌握筛分法测定颗粒饲料含粉率和回转箱法测定颗粒饲料粉化率的方法，评价所测颗粒饲料含粉率与粉化率是否合格。

二、实验原理

    含粉率是指颗粒饲料中所含粉料重量占其总重量的百分比。颗粒饲料粉化率是指颗粒饲料在粉化仪对颗粒饲料翻转摩擦后产生粉末的重量占其总重量的百分比。而100%减去粉化率就是颗粒饲料的坚实度。本方法适用于一般硬颗粒饲料的含粉率和粉化率的测定。

三、实验器具与材料

1）粉化仪。

2）标准筛一套。

3）振筛机。

4）天平，感量0.5g。

四、实验步骤

1）试样选取与制备

    颗粒饲料冷却lh后测定，从各批颗粒饲料中取出有代表性的原始样品1.5kg左右。当检验颗粒饲料质量时，可直接选择有代表性的颗粒饲料即可。

2）含粉率的测定

将原始样品用规定筛号的金属筛(表5-1)分3次用振筛机预筛1min，将筛下物称重。计算3次筛下物总重占试样总重的百分数，即为含粉率。然后将筛上物称取2份试样，每份500 g。

3）粉化率的测定

将称好的2份试样分别装入粉化仪的回转箱内，盖紧箱盖，开动机器，使箱体回转10 min(500 r·min-1)。停止后取出试样，用规定筛孔的筛子在振筛机上筛理1min，称取筛上物的重量，计算2份试样测定结果的平均值。

4）结果计算

①含粉率(W1)的计算：

   W1=m1/m2×100%

式中：W1为试样含粉率；m1为预筛后筛下物总重量，g；m2为预筛试样总重量，g。

②粉化率(W2)的计算：

   W2=1－m/500×100%

式中：W2为试样粉化率；m为回转后筛上物重量，g。

所得结果表示至小数点后两位。

五、作业

1.   简述配合饲料含粉率和粉化率的测定步骤

2.   简述配合饲料含粉率和粉化率的测定意义

实验八、自制颗粒饲料硬度的测定（3学时）

一、实验目的

    测定饲料颗粒硬度，使学生掌握饲料颗粒硬度测定的方法

二、实验原理

通过对单颗粒径向加压、使其破碎，以此时的压力表示该颗粒的硬度；用多个颗粒的硬度的平均值表示该样品的硬度。

三、实验器具与材料

GWJ-1谷物饲料颗粒硬度计

四、实验步骤

1、样品制备：从每批颗粒饲料中选出有代表性的样品约20g，再用四分法从每批样品中选取长度在6mm(以颗粒两头最凹处计算)以上，长度、大小大体上相同的颗粒20粒。

2、将硬度计的压力指针调整至零点，用镊子将颗粒横放在载物台上，正对压杆下方。滚动手轮，使压杆下降，速度中等、平均，直至颗粒破碎，立即读取压力数值(X1)。清扫载物台上的饲料碎屑，将压力指针重新调整至零点，开始下一样品的测定（X2，X3…X20）。

3、计算：X=(X1+X2+…+X20)/20

式中：X为样品硬度(kg)；

X1…X20为各单粒样品的硬度。

实验九、自制配合饲料水分的测定（6学时）

一、实验目的：

测定配合饲料及单一饲料中干物质量，是学生掌握饲料水分测定的方法。

二、实验原理

饲料中营养物质，包括有机物质与无机物质均存在于饲料的干物质中。饲料中干物质含量的多少与饲料的营养价值及家畜的采食量均有密切的关系，风干饲料例如各种籽实饲料、油饼、糠、麸、藁秕、青干草、鱼粉、血粉等可能直接在100-105℃温度下烘干，烘去饲料中蛋白质、淀粉及细胞膜上的吸附水，得到风干饲料的干物质量。含水分多的新鲜饲料如青饲料、青贮饲料、多汁饲料以及畜粪和鲜肉等均可先测定初水分后制成半干样本；再在100-105℃温下烘干，测定半干样本的干物质量，而后计算新鲜饲料或鲜粪或鲜肉中干物质量%。

三、实验器具和材料

干燥器、称量皿、烘箱、分析天平（0.0001）、镊子等。

四、实验步骤

1.   取样: 用干净光滑的塑料袋剪成一张20cm×20cm的正方形塑料布，将冷冻干燥后粉碎好的样品倒在这张塑料布上，提起一角，使样品流向对角，随即提起对角使其流回，继续按照前述方法混合均匀，缩分，直至剩余样品数量为6克为止。

2.   干燥器用变色硅胶做干燥剂，105摄氏度烘4小时,硅胶由白色变为蓝色为止。

3.   称量皿用自来水清洗称量皿，洗净后用蒸馏水淌洗两遍，然后将其置于105±5℃烘箱中烘1h，取出后在干燥器中冷却30 min，称重至0.0002g，再烘干1小时，同样冷却称重。

4.   用已经恒重好的称量皿称取风干样品2.5g，样品中含水量应保持在0.1g以上，皿内铺开厚度应该在4mm以下，称量准度至0.0002g；

5.   把烘箱温度设置到105摄氏度，在105±5℃烘箱中烘7h，取出，盖好称量皿盖，在干燥皿中冷却30 min，称重；

6.   称量后的样品再烘1h，在干燥皿中冷却30 min，称重，直至两次称重之差小于0.002g，即为恒重，记录重量之差小于0.002g的两次称重，求其平均值即为绝干物质重。

7.   结果计算

根据如下的公式计算样品总水分含量：

1)   总水分（％）＝初水重（％）＋[100-初水重（％）]×风干样水分百分含量

2)   初水重（％）＝[（湿重－风干重）/湿重]×100

五、作业

1．某种饲料半干样本105℃干物质含量为90%，该饲料空气干燥干物质含量为30%，计算该种饲料的干物质含量。

2．某种饲料半干样本105℃干物质含量为90%，该饲料70℃干物质含量为32%，计算该种新鲜饲料的干物质含量。

实验十、自制配合饲料粗蛋白的测定（6学时）

一、实验目的

掌握饲料粗蛋白质含量的测定方法，并测定各种样本的粗蛋白质含量。

二、实验原理

饲料中含氮物质包括纯蛋白质和氨化物（氨化物有氨基酸、酰胺、硝酸盐及铵盐等），两者总称为粗蛋白质。凯氏定氮法的基本原理是用浓硫酸分解样本中蛋白质与氨化物，使之都转变成氨气，氨气被浓硫酸吸收变为硫酸铵。硫酸铵在浓碱的作用下放出氨气。通过蒸馏，氨气随汽水顺着冷凝管流入硼酸溶液（注2），与之结合成为四硼酸铵，后者用盐酸或硫酸标准液滴定，即可测定放出的氨氮量。根据氮量，乘以特定系数，一般为6.25（注3），即可得出样本中粗蛋白质含量。

三、实验器具与材料

分析天平、电炉至少两台、酸式滴定管、凯氏烧瓶、凯氏蒸馏装置、锥形瓶、98%的浓硫酸、混合催化剂、40%氢氧化钠、2%硼酸等。

四、实验步骤

1.   饲料的消化

2.   氨的蒸馏：将试样消煮液冷却定容至100ml的容量瓶中，为试样分解液。使半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入此溶液。准确移取试样分解液5ml注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，并在入口处加水封闭好，防止漏气，蒸馏4分钟，使冷凝管末端离开吸收液面空蒸1分钟，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。

3.   滴定：用硼酸吸收氨后，立即用0.01mol/L的盐酸标准溶液滴定,反应液变为浅红色时为滴定终点，记下所用盐酸的数量。

4.   空白测定:在测定含氮量的同时，应做一空白对照测定，即各种试剂的用量及操作步骤完全相同，但不加样本，这样可以校正药品不纯所发生的误差。

5.   计算: 每ml的1mol/L盐酸标准溶液相当于0.014克的N, 因此N%×6.25=粗蛋白质(%)=(V₂-V₁) ×C×0.0140×6.25×100

式中: V₂－试样滴定时所需酸标准液的体积(ml)

V₁－空白滴定时所需酸标准溶液体积（ml）

C－盐酸标准溶液的浓度

五、作业

1.   1公斤饲料中含有25克粗蛋白质，则1公斤饲料中含有多少克氮？

2.   1毫升0.0100NHCL溶液相当于0.00014克氮，如何求得？

实验十一、自制配合饲料粗脂肪的测定（3学时）

一、实验目的

掌握饲料及畜体、畜产品及粪中粗脂肪测定方法，并能够测定各类饲料中粗脂肪含量。

二、实验原理

饲料的油脂均可溶解于乙醚中，用乙醚反复浸提饲料中的脂肪，并使溶有脂肪的乙醚流集于盛醚瓶，而后将乙醚蒸发，瓶中所剩残渣的重量为饲料的脂肪量。

三、实验器具与材料

电热恒温水锅浴、鼓风电热烘箱、索氏脂肪提取仪、干燥皿、称量皿、无水乙醚等。

四、实验步骤

1.   将干燥皿中的变色硅胶倒入白色大磁盘中均匀铺开，然后放入30℃的鼓风电热烘箱烘三天，直至其变为蓝色为止。

2.   将索氏脂肪提取仪用自来水清洗两遍,再用双蒸水清洗两遍,放入105℃烘箱中烘干,然后在抽提瓶中装入无水乙醚120ml,同时装入数粒沸石,在水浴锅上安装好。将测定粗水分后的绝干样品混合均匀，于密封袋中保存，备用。

3.   将称量皿在（105±2）℃烘箱内烘干1-2h，取出放入干燥器内冷却30min，称量。再烘30min，同样冷却，称重。两次称重之差小于0.0008g为恒重。

4.   用镊子取出滤纸包放入抽提器内，滤纸包应完全浸入乙醚，向抽提瓶内加60-100ml乙醚，装好回流装置，在65-75℃水浴上加热回流，控制乙醚回流速度为每小时8-10次，共回流50-70次。大约抽提12个小时。称量皿立即放入干燥皿中，备用。

5.   将抽提后的滤纸包用镊子取出放入称量皿中，放在通风橱柜中待乙醚挥发完全后置于（105±2）℃烘箱内烘1h，冷却，称量。两次称量之差小于0.001g为恒重(m₂)。

6.   结果计算

粗脂肪的含量按公式（3-5）计算

式中：w(EE)-粗脂肪的质量分数

m₁-抽提前恒重的称量皿和样品包总重（g）

m₂-抽提后恒重的称量皿和样品包总重（g）

m-冷冻干燥后样品质量（g）

五、作业

1．盛有粗脂肪的盛醚瓶在100-105℃烘箱内的时间为什么不能过长？过长是否会影响测定结果？

2．脂肪包的长度为何不能超过虹吸管的高度？

实验十二、自制配合饲料粗灰分的测定（3学时）

一、实验目的

掌握饲料中粗灰分（矿物质）测定法，并测定各种样本的粗灰分（矿物质）量。

二、实验原理

饲料中的灰分，即饲料中的矿物质或称无机盐，主要为钾、钠、钙、镁、硫、硅、磷、铁及其它微量元素。测定方法是，饲料样本中有机物质的主要元素如氮、氢、氧、碳等在高温下（400-600℃）烧灼后被氧化而逸失，所剩残渣总称为“粗灰分”。粗灰分包括饲料中所含各种矿物质元素的氧化物和少量杂质，如粘土、砂石····等，纯灰分则不含杂质。杂质无营养价值。

三、实验器具与材料

分析天平、高温电阻炉、干燥器、30ml的瓷坩埚、干燥箱、可调电炉、硝酸(AR)等。

四、实验步骤

1.   将坩锅用水洗净后，放入温箱内烘干，然后转入高温电阻炉内，于（550±20）℃灼烧30 min，取出，在空气中冷却约1min，放入干燥器内冷却30min，称量。将此两次称得的坩锅重记录于预先设计好的表格上。

2.   在恒重的瓷坩锅称取风干样品2.5克左右，置于可调电炉上用微火炭化，直至灰分变白或灰白无炭粒存在为止。

3.   取出，在空气中冷却约1min，放人干燥器内冷却30min，称量。再灼烧30min，冷却，称量，直至两次称量之差小于0.001g为恒重(M1)，并将此两次称得的重量记录于预先设计好的表格上。

4.   结果计算

饲料粗灰分占风干物质的质量分数按如下公式计算：

W=(M₁-M_O)/M*100

式中： M₁—坩埚和灰分的总质量(g)

Mo—坩埚的质量(g)

五、作业

1．为什么坩埚加高温后，坩埚钳亦需烧热后才可夹取？

2．如何计算饲料中的有机物质含量？

实验十三、自制配合饲料中钙的测定（6学时）

一、实验目的

掌握应用高锰酸钾法测定饲料中钙含量法，并用以测定各种样本的含钙量。

二、实验原理

将试样中有机物质破坏，钙变成溶于水的离子，并与盐酸反应生成氯化钙，然后在溶液中加入草酸铵溶液，使钙成为草酸钙白色沉淀，再用硫酸溶液溶解草酸钙沉淀，再用高锰酸钾标准溶液滴定游离的草酸根离子。根据高锰酸钾标准溶液的用量，可计算出试样中钙的含量。主要化学反应式如下：

CaCl2+（NH4）2C2O4→CaC2O4↓+2NH4Cl

CaC2O4+H2SO4→CaSO4+H2C2O4

2KMnO4+5H2C2O4+3H2SO4→10CO2↑+2MnSO4+8H2O+K2SO4

三、实验器具与材料

实验室用样品粉碎机或研玻、分析筛、分析天平、高温电炉、坩埚、容量瓶、移液管、可调温电炉、酸式滴定管、玻璃漏斗、定量滤纸、烧杯、凯式烧瓶、盐酸溶液、硫酸溶液、氨水溶液、42g·L-1草酸铵溶液、甲基红指示剂、浓硝酸、氨水溶液、高锰酸钾标准溶液等。

四、实验步骤

1.   灰分的制备与溶解：用已测定灰分的样本。在盛灰坩埚中加入（1：3）的HCl 10mL和浓硝酸数滴，小心煮沸。将此溶液转移到100mL容量瓶中，用热蒸馏水洗涤杯及滤纸数次，待滤液冷至室温后，定容、摇匀，为试样分解液。此供试液可用以测定钙、磷。

2.   草酸钙沉淀：准确移取试样分解液10～20 mL（含钙量20mg左右）于烧杯中，加蒸馏水100mL，2滴甲基红指示剂，溶液即成为红色。滴加氨水（1：1）至溶液为橙色，再加盐酸溶液使溶液恰变红色（PH约为2.5～3.0）。小心煮沸，慢慢滴加草酸铵溶液10mL，并不断搅拌。如溶液变橙色，应补滴盐酸溶液至红色。煮沸数分钟，放置过夜使沉淀陈化（或在水浴上加热2h）。

3.   草酸钙沉淀的洗涤：次日用精密定量滤纸过滤，弃去滤液，草酸钙沉淀用（1：50）氨水溶液多次冲洗。直至草酸钙全都洗净为止（测定草酸铵洗净的方法：用试管接滤液2～3mL，在滤液中加（1：3）硫酸数滴，加热试管，再加一滴高锰酸钾标准溶液，如呈微红，30秒钟不褪色即可。）。

4.   沉淀的溶解与滴定：将滤纸和沉淀一起放入原烧杯中，而后加（1：3）硫酸10mL，蒸馏水50mL，加热到75～80℃。立即用0.05 mol·L-1高锰酸钾溶液滴定，直至溶液呈微红色，且30s不褪色为终点。

5.   空白：在干净烧杯中加滤纸一张， 1：3的硫酸10mL，蒸馏水50mL，加热到75～80℃。用0.05 mol·L-1高锰酸钾溶液滴定，直至溶液呈微红色，且30s不褪色为终点。

6.   结果计算

                （V3-V0）·c·0.02        V1

Ca（%）=———————————— ×——×100%

                         m               V2

式中：m=样本重（克）

      V1=样本灰化液稀释体积（mL）

      V2=测定钙时样本溶液移取体积（mL）

      V3=滴定样本溶液消耗KMnO4标准溶液体积（mL）

      c=KMnO4标准溶液浓度（mol·L-1）

0.02为与1.00mL KMnO4标准溶液[C（1/5 KMnO4）=1.000 mol·L-1]相当的以克表示的钙质量。

五、作业

1．样本溶液中为何需先加氢氧化铵，后加盐酸？

2．为什么需用氢氧化铵液冲洗草酸钙沉淀直到剩余的草酸铵洗净为止？

实验十四、自制配合饲料中磷的测定（6学时）

一、实验目的

掌握应用比色法测定饲料中磷含量法，并用以测定各种样本的含磷量。

二、实验原理

将试样中有机物质破坏，使磷游离出来，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理，生成黄色的磷-钒-钼酸复合体（（NH4）3PO4NH4VO3·16MoO3），在波长420nm下进行比色测定。根据所产生黄色的深浅，应用比色计，即可计算样本中的磷量。

三、实验器具与材料

实验室用样品粉碎机或研玻、分析筛、分析天平、分光光度计、高温电炉、坩埚、容量瓶、刻度移液管、可调温电炉、酸式滴定管、玻璃漏斗、定量滤纸、盐酸、浓硝酸、钒钼酸铵显色剂、标准磷溶液等。

四、实验步骤

1.   标准曲线绘制：准确移取磷标准溶液（50μg·mL-1）0、1.0、2.0、5.0、10.0、和15.0mL于50mL容量瓶中，各加入钒钼酸铵显色剂10mL。用蒸馏水稀释至刻度摇匀，放置十分钟以上，以0mL溶液为参比，用10mm比色杯，在波长420nm下，用分光光度计测定各溶液的吸光度。以磷含量（毫克数）为横坐标，相应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2.   试样测定：精确移取试样分解液1～10mL（含磷在50～750μg）于50mL容量瓶中，加显色剂10mL，按五、1进行比色测定，以空白为参比，测得试样分解液的吸光度。由标准曲线查出磷含量，并换算成总磷量。

3.   计算

a×V/V1

磷含量（微克/克样品）=——————

m

式中：a——为标准曲线上查出的含磷量（mg）；

      m——样品质量（g）；

      V1——移取试样分解液的体积（mL）；

      V——试样分解液的总体积（mL）。

五、作业

1．测磷时形成“钼蓝”的溶液需静置半小时后再比色，为什么？

2．经用灰化法或消化法制备的样本液如果浑浊，是否会影响磷的比色结果？

 

版块五：水产动物医学实践

模块	序号	课程名	实验项目/内容板块	学时	类型	能力目标
水产动物疾病	1	水产动物疾病学	水产动物疾病临床诊断	6	综合	掌握水产动物临床检测的内容和顺序；了解一些疾病的特征性病变。
	2		病原菌的分离与鉴定	6	综合	明确细菌性病原的分离步骤；掌握细菌性病原的鉴定方法；了解斑点叉尾鮰爱德华氏菌的发病特征。
	3		病原菌的药物敏感实验	4	综合	学习并掌握纸片扩散法的基本原理和方法；了解不同致病菌的药物敏感范围。
	4		病毒性疾病的PCR检测	6	综合	了解并掌握病毒的PCR检测方法；掌握RNA提取及cDNA反转录方法；掌握组织DNA提取方法。
	5		寄生虫性病原的检测	4	综合	了解并掌握常见水产动物疾病寄生虫种类；掌握血涂片和压片的制作方法。
	6		水霉的检测与培养	6	综合	了解并掌握水霉的形态特征；掌握水霉培养基的制作及培养方法。
	7		组织病理切片的制作与观察	8	综合	掌握组织病理切片技术和制备方法；区别常见几种病理变化形态。
	8	水产药物与药理学	常用抗菌药物的MIC和MBC测定	6	综合	掌握MIC和MBC的测定方法；了解中药煎剂制备方法。
	9		常用水产药物的急性毒性试验	12	综合	了解常见水产药物的急性毒性实验的原理；掌握常见水产药物的急性毒性实验的方法。
	10		常见商品渔药的识别与应用	4	综合	了解并认识商品渔药的种类；掌握不同渔药的使用方法。
	11	鱼类免疫学	细菌灭活苗的制备及免疫接种	8	综合	掌握细菌灭活苗的制备方法；熟练疫苗的免疫接种技术。
	12		琼脂糖扩散和玻片凝集法检测血清中的抗体效价	8	验证	掌握琼脂扩散法测定血清中的抗体效价的操作步骤；掌握玻片凝集法测定测定血清中的抗体效价的操作步骤。
	13		间接ELSIA测定血清中的抗体效价	8	验证	掌握ELISA方法的原理；掌握ELISA 的操作方法与注意事项。

 

实验一  水产动物疾病临床诊断（6学时）

一、实验目的

1、掌握水产动物临床检测的内容和顺序。

2、了解一些疾病的特征性病变。

二、实验原理

1、运用水生动物解剖学知识，辨认各组织器官。

2、运用病理学知识，区别正常组织与病变组织。

三、实验器具与材料

白瓷盘、剪刀、镊子、直尺、鱼安定、患病黄颡鱼、温度计、塞氏透明度盘、临床检测记录表、手套、水质检测试剂盒（溶氧、氨氮）等。

四、实验步骤

1、问诊

问诊即询问养殖户而获取病史资料的过程。问诊在疾病的诊断中具有重要作用。一方面，可为疾病的下一步检查方案提供重要依据，而且可以补充客观检查的不足。问诊项目包括：引种、养殖、环境、水源、发病及治疗情况（附件1）

2. 水体检测

   水体检测主要内容包括：水温、透明度检测、pH、溶氧、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐等。

2.1 温度检测

采用水下温度计进行检测，这种温度计适用于水深40m以内的水温测量。将水温计投入水中至待测深度，感温5min后，迅速上提并立即读数。从水温计离开水面至读数完毕应不超过20s。

2.2 透明度检测

选用无直射关照，水面平稳的水域作为测定地点。将塞氏盘缓慢放入水中水下恰好看不见盘面白色时即为测定水域透明度深度，记录绳子长度。

2.3 水样采集

每个养殖点选择3-5个检测点，每个点选取上、中、下层采集水样（河道及流水养殖场需选取上、中、下游采集水样）。

（1）、溶氧检测：参照养殖水体《溶解氧快速检测试剂盒分析盒》说明书进行操作，测定溶解氧含量。

（2）、pH检测：使用pH试纸，测定水体中pH值。

（3）、氨氮检测：参照养殖水体《氨氮试剂盒》说明书进行操作，测定氨氮含量。

（4）、硝酸盐：参照养殖水体《硝酸盐试剂盒》说明书进行操作，测定硝酸盐含量。

（5）、亚硝酸盐：参照养殖水体《亚硝酸盐试剂盒》说明书进行操作，测定亚硝酸盐含量。

3、鱼体临床检测

3.1 鱼样采集：

要求样品要有代表性。一是要选择典型动物，即没有经过药物治疗、症状典型的动物，这对细菌性传染病的检查尤为重要。 二是选择典型材料，即采集病原体可能在其中含量最高或病变明显的材料。

对有临床症状的水生动物，必须挑选临床症状明显的活体或濒临死亡的水生动物。每一采样批次，一般根据水生动物样品的大小选取10尾-20尾即可。对于外表健康无临床症状的水生动物采样对象按照下表中2%感染率时采样数要求取样，原则上每个采样批次采150尾（要有代表性）。

3.2 检查流程

按照从体表到鳃再到内脏的顺序依次检观察。

（1）、体态与体表症状观察

在水体内观察病鱼精神状况、游动姿态、摄食情况、鱼体规格。将患病鱼体置于白瓷盘中，按顺序从脊柱→头→嘴→眼→鳃盖→鳞片→鳍条→肛门仔细观察。

（2）、剖检病变观察

将鱼体麻醉后，置于白瓷盘中。A.在鱼的肛门前端沿腹中线剪起至围心腔前端止（图）；B.在起剪点沿肛门斜向上至侧线，再沿侧线下方剪至胸鳍基部，再斜向下剪至前一步骤的终点；C.观察鱼内脏病变情况。

图1-4A 鱼体解剖，内脏观察

A、肠道

口咽腔有无充出血；胃、肠道壁厚薄，浆膜和黏膜有无充血、出血；胃肠道有无鼓气，内容物颜色、形态，有无套肠现象，有无寄生虫等。

B、肝

观察外表，注意它的色泽、 大小、有无溃烂、病变、白点和瘤等表现。在肝的表面，有时可发现复殖吸虫的胞囊或虫体。如果有白点，往往是粘孢子虫、微孢子虫或球虫。

C、脾

脾脏的检查和肝脏相同，往往可发现粘孢子虫的孢子或胞囊，有时也可发现吸虫的囊蚴。

D、胆囊

取出胆囊时要特别小心，不要把它弄破，否则胆汁溢出，既会沾染其它器官。取出胆囊后，放在培养皿里，先观察外表，注意它的颜色有无变化有无其它可疑的病象等，然后取一部分胆囊壁，放在载玻片上，盖上盖玻片，压平、放在显微镜下观察。胆汁另行检查，在胆囊里，可发现六鞭毛虫、粘孢子虫、微孢子虫，以及复殖吸虫和绦虫幼虫等寄生虫。胆囊壁和胆汁，除用载片法在显微镜下检查外，都要同时用压缩法或放在培养皿里用解剖镜或低倍显微镜检查。

E、心脏

用小剪刀剪开围心腔，剪下心脏，最好能把心脏和大的血管一起取下，放在盛有生理盐水的培养皿里。检查完外表之后，把心脏剪开，可发现血居吸虫和线虫。用小镊子取一滴内含物，用显微镜检查，可发现锥体虫、拟锥体虫和粘孢子虫。同时也用压缩法进行。在生理盐水里形成的沉淀物也要检查。

F、鳔

取出鳔时，不要把它弄破，先观察它的外表，再把它剪开，可发现复殖吸虫、线虫。用镊子剥取鳔的内壁和外壁的薄膜，放在载玻片上排平，滴入少许生理盐水，在显微镜下观察，可发现粘孢子虫的孢子和胞囊，同时用压缩法把整个鳔检查。

G、肾

肾脏紧贴在脊柱的下面，取出肾时，要尽量把整个肾完整地取出，也像检查肝和脾等器官一样进行检查，如果肾脏很大，用显微镜检查时，要前、中、后三部分各检查两片。在肾脏可发现粘孢子虫、球虫、微孢子虫，有时也可发现锥体虫或拟锥体虫；复殖吸虫、线虫等幼虫。

H、膀胱

取出膀胱时要特别小心，因为膀胱往往不大明显，容易被忽略。有些鱼类，例如鲤科鱼类，一般没有膀胱。要完整地取出膀胱，首先，要把接近膀胱附近的一部分肌肉一起剪下来，放在玻片上，仔细地找出膀胱和两根输尿管，将它从附带的肌肉上分离出来，没有膀胱的鱼，则检查输尿管。取出膀胱和输尿管后，用小剪刀把它们剪开，用显微镜或解剖镜检查；分别检查它们的内含物和壁膜，可发现六鞭毛虫、粘孢子虫、复殖吸虫等。

I、性腺

性腺有左右两个，把左右两个性腺小心地取出来，先用肉眼观察它的外表，如果有很小的白点，往往是微孢子虫的胞囊。还可发现粘孢子虫、球虫、复殖吸虫囊蚴、绦虫的双槽蚴、线虫等寄生虫。

J、眼

用弯头镊子或小剪刀，从眼窝里挖出眼睛放在玻璃皿或玻璃片上，剖开巩膜，放出玻璃体和水晶体，在低倍显微镜或解剖镜下检查，可发现寄生在眼睛各部分的吸虫幼虫，这种寄生虫严重感染时，水晶体变成白色，混浊不透明，使眼睛变瞎。用载玻片法在显微镜下检查，在眼的结缔组织里，有时还可发现粘孢子虫。

K、脑

要取出脑，可用尖锐的解剖刀或剪刀，按水平方向，从后面向前，在后脑和眼睛之间剪开头盖骨上壁，可见充满着淡灰色泡沫状的油脂物质，用吸管把它吸出，放在玻皿里检查，吸净油脂物质后，灰白色的脑即显露出来，用剪刀把它完整地取出来，按检查肝、脾等器官一样检查，可发现粘孢子虫和复殖吸虫的胞囊或尾蚴。

L、脊髓

取出脊髓的方法，可从头部与躯干交接处把脊椎骨剪断，在把身体的尾部与躯干交接处的脊椎骨也剪断，用剪子从前段的段口插入脊髓腔，把脊髓夹住，慢慢地把脊髓整条拉出来，然后按检查肠和肾一样，分前、中、后三部分检查，可发现粘孢子虫和复殖吸虫的幼虫。

M、肌肉

检查肌肉，首先要用锐利的解剖刀，从身体的一侧前剖割开一部分皮肤，再用镊子把皮肤剥去；或用一根小棍棒（玻璃棒或竹棒）象卷纸筒一样，慢慢地把皮肤卷剥，剥取皮肤后，肌肉即露出来，用肉眼检查后，先在前、中、后等部分取一小片肌肉放在载玻片上，盖上盖玻片，轻轻压平，在显微镜下观察，再用压缩法检查。肌肉也是许多不同种类的寄生虫寄生部位。例如粘孢子虫、复殖吸虫、绦虫、线虫等的幼虫都可发现，还可发现引起赤皮病和疥疮病的细菌。

五、作业 

1、描述患病鱼体临床检测顺序，记录发病主要症状及发病情况。

2、记录养殖水体水质指标。

实验二  病原菌的分离与鉴定   （6学时）

一、实验目的

1、明确细菌性病原的分离步骤。

2、掌握细菌性病原的鉴定方法。

3、了解斑点叉尾鮰爱德华氏菌的发病特征。

二、实验原理

1、运用水生动物疾病学知识，对疾病进行初步诊断

2、运用微生物学知识，进行细菌的分离和生化鉴定

3、运用分子生物学技术，对细菌进行PCR鉴定

三、实验器具与材料

白瓷盘、灭菌（剪刀、镊子）、鱼安定、患病黄颡鱼、载玻片、接种环、酒精灯、细菌培养皿、革兰氏染色液、超净工作台、高压灭菌锅、75%消毒酒精、恒温培养箱、PCR仪等。

四、实验步骤

1、细菌的分离

（1）、消毒准备

将包扎好灭过菌的剪刀、镊子、接种环和解剖盘放入超净工作台；将试管架、酒精灯和酒精棉球、接种环、烙铁等放入超净工作台；打开紫外灯，表面消毒15～20min；启用时，关闭紫外灯。

 

（2）、患病鱼体消毒

将病鱼置于超净工作台上；用酒精棉球在病鱼体表上进行消毒；消毒完成后按剖解技术的规范操作对病鱼进行剖解。

（3）、内脏器官表面消毒

待剖解完成后，内脏器官完全暴露；用烧红的烙铁烧灼内脏器官的表面消毒

剪头所指的是经烧灼的肝脏表面。

（4）、勾取适量组织

将接种环在酒精灯上烧红；将烧红接种环对经烫烧的脏器表面进行穿刺；

确保接种环能勾取适量组织；取出接种环后准备在营养培养基上划线接种。

（5）、平板划线接种

用记号笔对培养基标记，然后用灭菌接种环勾取适量组织后接种于培养基；将培养基放置恒温培养箱培养24～48h。

（6）、平板上生长的细菌

观察培养基上菌落颜色、形态、直径大小、是否光滑、边缘是否粗糙等；从中挑取圆形、隆起、光滑、边缘整齐，半透明的直径约1mm的小菌落在LB平板进行纯化培养。

2、细菌的鉴定

（1）、革兰氏染色

 细菌置于载玻片上，风干后，染色：结晶紫（1-2min），碘液（2-3min），酒精（15-30s），品红（10-15s）。细菌染色后光学显微镜下观察，若菌体染为紫色，则为革兰氏阳性菌；若菌体染为红色，则为革兰氏阴性菌

（2）、生理生化试验

A.        硫化氢试验

  培养基黑色为阳性、不变黑色为阴性。

B.        运动性试验

把待检菌穿刺接种于半固体琼脂，28℃培养24h。若待检菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性;若待检菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，为运动性阴性。

C.        氧化酶试验

  以毛细管吸取四甲基对二苯胺的1％水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性；不变色为阴性。

D.       丙二酸盐试验

培养基由绿色变为蓝色为阳性；不变蓝色为阴性。

E.        吲哚试验

培养基变红色为阳性；不变红色为阴性。

F.         甲基红（M·R）试验

培养基变红色为阳性；不变红色为阴性。

G.       过氧化氢酶（接触酶）试验

有气泡产生为阳性；不产生气泡为阴性。

H.       DNA酶试验

  将待检菌接种于DNA酶培养基平板上，28℃培养48h。菌落周围培养基出现粉红色晕圈为阳性；无模糊晕圈这为阴性。

I.          酯酶（Tween 80）试验

  将待检菌接种于酯酶（Tween 80）测定培养基平板，28℃培养7d在细菌生长的周围有模糊晕圈者为阳性；无模糊晕圈者为阴性。

J.          硝酸盐还原试验

  若呈红色为阳性；不呈红色为阴性。

K.        糖、醇类（D-葡萄糖、D-甘露醇）发酵试验

  将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基，28℃培养24h后观察。培养基变黄色为阳性，不变黄色为阴性。

（3）、16S rRNA基因DNA的序列测定和同源性分析实验

DNA提取

A.        将7.2分离纯化的待检菌接种于LB培养基中，以28℃摇床培养24h。

B.        取2mL待检菌培养液，12000r/min离心1min，收集菌体。

C.        菌体悬浮于500μL TE缓冲液（PH8.0），震荡悬浮，加入50μL 10％的SDS溶液，10μL 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温育1h。

D.       加入100μL 5mol/L的NaCl溶液，充分混匀，再加入100μL CTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育20min。

E.        加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），混匀，12000r/min离心5min。

F.         取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），混匀，12000r/min离心5min。

G.       取上清液，加入1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，10000r/min离心10min；沉淀用70％酒精洗涤2次，室温晾干。

H.       加入50μL的TE缓冲液溶解，-20℃贮存，备用。

16S rRNA基因DNA序列扩增

A.        引物设计与合成

表1 细菌16S rDNA基因通用引物

B.        在PCR管中加入10×PCR缓冲液（无Mg²⁺ ）5.0μL，MgCl_2­（25mmol/L）5.0μL，dNTP_s（10mmol/L）1.0μL，引物(20μmol/L)P1和P2各1.0μL，Taq DNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，无菌双蒸水35.5μL。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。如果使用无热盖的PCR仪，需在反应混合物上覆加2滴矿物油。混匀后，3000r/min离心30s。

C.        将PCR管置于PCR仪，按下列程序进行PCR扩增：94℃预变性2min；94℃变性45s；52℃退火1min；72℃延伸1min；35次循环；72℃延伸7min；4℃保温。

D.       琼脂糖凝胶电泳: 用TAE电泳缓冲液配制1％的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述6μL样品和2μL溴酚蓝指示剂溶液混匀后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120V电泳约20min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察电泳条带的数量和位置。在长波紫外灯下用刀片切下含目的条带（约1500bp）的胶块，放入无菌离心管中称重。

PCR扩增产物纯化、测序及序列比对 

A.        按每0.1g琼脂糖凝胶加0.1mL酚，将酚加入含有目的条带胶块的离心管中。

B.        经漩涡震荡仪震荡1min-2min，将离心管在-70℃放置1h，使凝胶完全冻结。37℃水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡震荡仪上震荡1min-2min；14000r/min离心5min。

C.        取上层水相转入另一个离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：:24:1），混匀，12000r/min离心5min。取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），混匀，12000r/min离心5min。

D.       向收集的水溶液中加入1/10体积的3mol/L的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，置-20℃过夜或-70℃放置1h-2h。14000r/min离心10min，弃上清。

E.        将沉淀的DNA溶于适当体积的TE缓冲液中，置-20℃保存，待测。

F.         将纯化的PCR扩增产物进行序列测定，并与参考序列进行比对分析。

3、 结果判定

（1）、菌落形态

  28℃培养24h-48h，形成圆形、隆起、灰白色、湿润并带有光泽、呈半透明状的菌落。

（2）、细菌染色

  革兰氏染色为阴性

（3）、生理生化试验

  生理生化反应试验见表1。

表1 鮰爱德华氏菌的生理生化反应结果

反应项目	结果	反应项目	结果	反应项目	结果
硫化氢	-	吲哚	-	酯酶	-
运动性	-	甲基红	-	硝酸盐还原	+
氧化酶	-	过氧化氢酶	+	D-葡萄糖	+
丙二酸盐	-	DNA酶	-	D-甘露醇	+

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

（4）、16S rRNA基因DNA的序列测定和同源性分析试验

  测定的16S rRNA基因DNA序列与附录所列的基因序列进行blast比较，同源性达98％以上。

4、综合判定

  符合以上所有特征者判定为斑点叉尾鮰爱德华氏菌病：

五、作业

1、描述爱德华氏菌的革兰氏染色形态。

2、描述斑点叉尾鮰爱德华氏菌的临床特征。

3、构建爱德华氏菌的进化树。

实验三  病原菌的药物敏感实验（4学时）

 一、实验目的：

1、学习并掌握纸片扩散法的基本原理和方法。

2、了解不同致病菌的药物敏感范围。

二、实验原理：

将含有一定量的抗菌药物纸片，平贴在已经接种被测细菌的琼脂培养基上，纸片中的抗菌药物溶解于培养基内，并向四周呈球面扩散，药物在琼脂中的浓度随离开纸片的距离增大而降低。同时含菌琼脂经孵育后细菌开始生长。在琼脂内的药物浓度恰高于该药对待检菌的最低抑菌浓度，该菌的生长就受到抑制，在含药纸片的周围形成透明的抑菌环。该法操作简单、容易掌握，但受多种因素的影响，使结果不够准确。要使结果可靠，操作上的技术细节必须经过标准化并加以控制。

三、实验器具与材料

细菌、TSA培养基、含抗生素（青霉素、红霉素、链霉素等12种抗生素）药敏纸片、镊子、接种环、涂布、酒精灯、95%酒精、75%酒精、脱脂棉等。

四、实验步骤

1、 接种平板

用棉拭子蘸取菌液（菌液浓度为1.5×10⁸ cfu/ ml）涂布整个培养基表面,反复几次，保证涂布均匀。或者往平板内加入0.2ml浓度为1.5×10⁸ cfu/ml的菌液，再用涂布棒涂布均匀。（注意：避免用过浓的菌液，禁用未经稀释菌或其它不标准菌液接种平板。）

2、 贴药敏纸片：

接种平板后，贴上药敏纸片。用镊子分别挟取含有不同抗生素的滤纸片，贴在已接种细菌的琼脂平板的表面，然后用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴紧。纸片可以一个一个的贴，也可以用贴纸片机。纸片要贴的均匀，每个平板上贴4~6片，各纸片中心相距约24 mm左右，纸片距平皿边缘约15 mm左右，各纸片间距离相等；直径150mm的平板可贴12张纸片，直径100mm的平板可贴5张纸片。纸片贴后不应在移动，因为有些药物会立即扩散。贴上纸片15分钟内，须把平板倒放在28 ℃培养箱中进行孵育。

3、读取结果

（1）、经37℃培养16~18h后，观察结果。菌液浓度合适且涂得好，抑菌环规则，细菌呈融合生长。如果出现单个菌落，说明接种量小，需重做试验，测量抑菌环直径需包含纸片直径。手持平皿从背面目测检查每块平板，借反射光（黑色无反光背景）观察抑菌圈的有无及其大小，并用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌环直径，单位为毫米。培养基中如果加血液，须打开平皿，借反射光，从正面量抑菌环。如果是葡萄球菌或肠球菌，须培养24h后，经透射光检查苯唑青霉素和万古霉素的抑菌环内有无耐药菌株的生长。抑菌环内有任何生长的表现都表明是耐药菌株。

（2）、肉眼见不到细菌明显生长的区域为抑菌环边缘，有很难辨认的细小菌落者不算。如抑菌环内有大菌落长出，须再移种出来，重新鉴定，重新做敏感试验。变形菌在某些抗菌药物纸片周围可弥漫生长到抑菌的区域内，但抑菌环边缘清楚，弥漫生长不算。甲氧苄胺嘧啶和磺胺药的拮抗剂会支持细菌生长，因而测这些药时可忽略轻微生长（80%以上受抑制），以浓密度生长的区域作为抑菌环的界限。

（3）、参照附录1标准对抑菌环的大小作出解释，以敏感度，中介或耐药的形式解释结果。 

五、作业

1、按照以下表格记录不同细菌的药物敏感情况：

                    药物敏感试验

 

抗生素 Antibiotics	含药量/(ug/片） Contents	抑菌环直径大小（mm） Diameter of inhibition zone	敏感性 Sensitivity
青霉素Penicillin	10U
庆大霉素Gentamicin	10
卡那霉素Kanamycin	30
链霉素 Streptomycin	10
阿齐霉素 Azithromycin	15
四环素Tetracycline	30
多西环素Doxycycline	30
环丙沙星Ciprofloxacin	5
恩诺沙星 Enrofloxacin	10
丁胺卡那Amikacin	30
多粘菌素B Polymyxin B	300
氟苯尼考 Florfenicol	30

 

注：敏感(S)；中介(I)；耐药(R)

Notes:  S:  sensitive; I:  low; R: resistant

2、分析不同细菌的药物敏感差异。

3、选择出最合适的抗菌药物。

实验四  病毒性疾病的PCR检测（6学时）

 一、实验目的：

1、了解并掌握病毒的PCR检测方法。

2、掌握RNA提取及cDNA反转录方法。

3、掌握组织DNA提取方法。

二、实验原理：

病毒分为DNA病毒和RNA病毒，通过DNA或RNA的提取及特异性基因的检测能够对待测病毒进行鉴定。常用的PCR检测方法包括：常规PCR检测、多重PCR检测、巢式PCR检测、RT-PCR及qPCR等方法。

常规PCR检测：通过体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。

多重PCR：又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。

巢式PCR：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

RT-PCR：逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。主要用于RNA病毒的检测。

qPCR：Real-time Quantitative PCR ，即实时荧光定量核酸扩增，能够对基因进行定量分析。主要用于病原定量检测。

三、实验器具与材料

鱼病样组织、组织DNA提取试剂盒、Trizol、氯仿、异丙醇、70%乙醇、cDNA反转录试剂盒、RNA and DNA free water，2.5 mM dNTPs、10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、DNA marker、loading buffer、琼脂糖、50×TBE、引物等。

主要仪器：台式高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、水平式电泳槽、紫外透射反射分析仪、微量加样器、Eppendorf、吸头与水浴箱等。

四、实验步骤

（一）、RAN提取及cDNA合成

1、组织中病毒RNA的分离：

病毒核酸（RNA）分离方法很多，实际应用时可灵活考虑。可选择市售商品化核酸提取试剂完成待检样本总RNA的分离。操作按TRIzol LS Reagent RNA提取试剂使用说明书进行，步骤如下：

（1）、在1.5mL离心管中加入250μL的PRRSV细胞培养物和750μL TRIzol LS，盖上管盖，倒置混匀，室温放置10min。

（2）、加入200μL氯仿，将匀浆剧烈振荡15sec，室温静置5min使核蛋白质复合体彻底裂解。

（3）、4℃ 12 000 rpm离心15min，将上层含RNA的水相移入一新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下层。

（4）、加入等体积的异丙醇，充分混匀液体，室温放置10min。

（5）、4℃ 12 000 rpm离心15min，弃上清，再用70%的乙醇洗涤沉淀，然后离心，再用吸头彻底吸弃上清，在自然条件下干燥沉淀，溶于适量DEPC处理的水中。直接用于RT-PCR或-80℃贮存，备用。

（6）、另外，也可选择异硫氰酸胍法完成PRRSV RNA的提取。

2、病毒cDNA第一链的合成（反转录，RT）

病毒cDNA第一链的合成参照Invitrogen公司的SuperScriptTMⅡ反转录酶使用说明进行，步骤如下：

（1）、于微量离心管中加入6μL RNA、2μL反转录引物：Oligo（dT）/Random primer混合物，混匀，65℃ 5min。

（2）、冰浴2min，离心。

（3）、继续加入以下组分：

5×反转录反应缓冲液           4μL

0.1 m M DTT                     2μL

2.5mmol dNTPs                     2μL

SuperScriptTMⅡ反转录酶         1μL（200U/μL）

RNA酶抑制剂               0.5μL（40U/μL）

DNAase and RNAase free water        2.5μL

（4）、混匀，42℃水浴50min，最后70℃水浴15min， 完成cDNA链合成。

取出后可以直接进行PCR，或者放于-20℃保存备用。试验中同时设立阳性和阴性对照。

（二）、组织病毒DNA提取（按照Takara组织基因组提取试剂盒操作说明进行）

1、组织裂解

（1）、取 2～25 mg的鱼病样肝脏组织置于 2 ml 离心管中，用剪刀尽可能地成碎块。加入180 μl的 Buffer GL、20 μl的 Proteinase K和 10 μl的 RNase A（10 mg/ml），于 56 ℃水浴至组织完全裂解（2～3小时）12,000 rpm离心 2分钟，去除杂质之后再进行续操作。（注）温浴时可常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解。

（2）、向裂解液中加入 200 μl Buffer GBl 和 200 μl 100% 乙醇，充分吸打混匀。

2、将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至 Spin Column中，12,000 rpm离心 2分钟，弃滤液。

3、将 500 μl的 Buffer WA加入至 加入至 Spin Column中，12,000 rpm离心 1分钟，弃滤液。

4、将 700 μl的 Buffer WB加入至 加入至 Spin Column中， 12,000 rpm离心 1分钟，弃滤液。（注））请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的 100% 乙醇。

请沿 Spin Column 管壁四周加入 Buffer WB，这样有助于完全冲洗沾附管壁上的盐份。

5、重复操作步骤 4。

6、将 Spin Column安置于 Collection Tube上， 12,000 rpm离心 2分钟。

7、将 Spin Column安置于新的 1.5 ml的离心管上，在 Spin Column膜的中央处加入 50 ～200 μl的灭菌水或 Elution Buffer，室温静置 5分钟。（注）将灭菌水或 Elution Buffer加热至 65 ℃使用时有利于提高洗脱效率。

8、12, 000 rpm离心 2分钟洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到 Spin Column膜的中央或再加入 50 ～200 μl的灭菌水或 Elution Buffer，室温静置 5分钟后，12, 000 rpm离心2分钟洗脱DNA 。

9、基因组 DNA保存于-20℃备用。

（三）、PCR扩增

根据扩增目的选择引物F与引物R，按TaKaRa公司Ex-Taq DNA 聚合酶使用说明进行，步骤如下：

（1）、按以下次序将各成分加入0.5ml 灭菌Eppendoff管中。

双蒸灭菌水               37.5μL

反转录产物                4μL

引物F（25pmol/μL） 0.5μL

引物R（25pmol/μL）       0.5μL

10×PCR Buffer        5μL

2.5mmol dNTPs             2μL

Taq酶                         0.5μL （5U/μL）

注意首先加入双蒸灭菌水，然后再按照顺序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面下。

（2）、全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到Eppendorf管底。

（3）在PCR扩增仪上执行如下反应程序：94℃ 3min；94℃ 30 sec，50℃ 45 sec，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min结束。可根据扩增目的基因的不同，选择不同的循环参数。

（四）、电泳检测

（1）、将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上，放好梳板，使梳板齿下沿距倒胶槽板1mm。

（2）、配制合适浓度的琼脂糖凝胶，如配制1.2％的凝胶，则称取琼脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至100ml，迅速混匀，待冷至60℃左右时，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混匀。倒胶至倒胶槽内，使厚度为3～5mm，排除气泡后待胶完全凝固，撕去两端胶带。

（3）、将倒胶槽置电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液使没过胶面2～3mm，轻轻拔出梳板。

（4）、加样：取2μL上样缓冲液于Parafilm膜上，加入PCR产物5μL，混匀后，加入点样孔中，不要溢出孔外。同时设DNA分子量标准。

（5）、电泳：样品在负极端，接通电源，5V/cm恒压电泳30～60min即可。

（6）、检测：电泳结束，关闭电泳仪电源，取出倒胶槽，将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在紫外灯300nm下观察，可见桔红色明亮带，根据电泳条带的位置判断结果。

（五）、结果判定

在阳性对照孔出现相应扩增带、阴性对照孔无此扩增带时判定结果。

若样品扩增带与阳性对照扩增带处于同一位置，则判定为PRRSV-RNA阳性，否则判定为阴性。

五、作业

1、绘制不同病毒的检测结果并分析原因。

2、分析DNA提取和RNA提取的异同及注意事项。

实验五  寄生虫性病原的检测（4学时）

一、实验目的：

1、了解并掌握常见水产动物疾病寄生虫种类。

2、掌握血涂片和压片的制作方法。

二、实验原理：

水产动物寄生虫根据形态特征可以分为：原虫（如鞭毛虫、孢子虫和纤毛虫等）、蠕虫（如单殖吸虫、复殖吸虫、绦虫、棘头虫和环节动物等）和甲壳动物（如桡足类、鳃尾类、等足类和软体动物等）等。

水产动物寄生虫根据寄生部位可以分为：体表寄生虫（如小瓜虫、本尼登虫、鱼虱）、鳃寄生虫（如车轮虫、三代虫、指环虫、中华鱼鳋）、肠道寄生虫（如绦虫、线虫）、血液寄生虫（如锥体虫）和全身多部位寄生虫（如黏孢子虫）等。

由于寄生虫形态较大，通过肉眼或者接种显微镜便可以观察到。

常见寄生虫形态特征：

1、小瓜虫：主要寄生在鱼类的皮肤、鳍、鳃、头、口腔及眼等部位，形成胞囊呈白色小点状，肉眼可见。严重时鱼体浑身可见小白点，故称白点病。成熟虫体内能够观察到马蹄形核（如图1）。

图1 小瓜虫

2、车轮虫：虫体侧面观如毡帽状，反面观圆碟形，运动是如车轮转动样。隆起的一面为前面或称口面，相对而凹入的一面为反口面。口面上有向左或反时针发方向螺旋状环绕的口沟，其末端通向胞口。口沟两侧个生一行纤毛，形成口带，直达前庭腔。反口面的中间为齿环和辐线环。在辐线环上方有一马蹄形的大核，一个长形的小核和一个伸缩泡，其中部向体内凹入，形成附着盘，用于吸附在宿主身上。车轮虫用附着盘附着在鱼体的鳃丝或皮肤上，并来回滑动。游泳时一般用反口面向前像车轮一样转动，所以称为车轮虫（如图2）。

图2 车轮虫

3、三代虫：三代虫身体扁平纵长，前端有两个突起的头器，能够主动伸缩，又有单细胞腺的头腺一对，开口于头器的前端，此虫没有眼点，口位于头器下方中央，下通咽、食道和两条盲管状的肠在体2两侧。体后端的固着器为一大形的固着盘。盘中央有2个大锚,大锚之间由2条横捧相连，盘的边缘有16个小钩，有秩序地排列着。三代虫用后固着器上的大锚和小钩固着在寄主的身上，同时前端的头腺也分泌粘液，用以粘着在寄主体上或像尺蠖一样的慢慢爬行。三代虫为卵胎生，在卵巢的前方有未分裂的受精卵及发育的胚胎，在大胚胎内又有小胚胎，因此称为三代虫（如图3）。

图3 三代虫

4、指环虫：指环虫的虫体通常为长圆形，动作像尺蠖，寄生在各种鱼类的鳃上、身体前端有4个瓣状的头器常常伸缩，头部背面有4个眼点，在体后端腹面有一个圆形的固着盘，盘的中央有2个大锚，盘的边缘有14个小构，在两大钩之间有l—2条横棒相连。口通常呈管状，可以伸缩，位于身体前端腹面靠近眼点附近，口下接一圆形的咽，咽下为食管，接着是分2支的肠，2条肠的末端通常在后固着盘的前面相连，使整个肠成环状，但也有不相连而呈直管状的（如图4）。

图4 指环虫

5、锥体虫：锥体虫的虫体呈狭长的叶状，从虫体的后部的基粒中长出一根鞭毛，沿着身体表面向体前伸出叫前鞭毛。沿体表的一段鞭毛和体表构成一条狭长的波动膜。在显微镜下看虫体的活体，很活泼地颤动，但不会移动位置。胞核卵形或椭圆形，约位于虫体中部（如图5箭头所示）。

图5 锥体虫（箭头所示）

6、锚头鳋：体大、细长，呈圆筒状，肉眼可见。虫体分为胸、胸、腹三部分，但各部分之间没有明显界限（如图6）。寄生在鱼体的为雌鳋，生殖季节其排卵孔上有一对卵囊。鱼体大量感染锚头鳋时，好像披着蓑衣，故称“蓑衣病”。

图6 锚头鳋

三、实验器具与材料

白瓷盘、剪刀、镊子、鱼安定、患病鱼、载玻片、盖玻片、显微镜、注射器、肝素钠、碘酒棉球、灭菌干棉球等。

四、实验步骤

1、血液采集与涂片

血液采集：

A.消毒: 在采血之前，应先用碘酒棉球对采血部位体表进行涂擦，再用灭菌干棉球擦干涂擦部位，待擦干后方可采血；B.采血: 尾静脉采用一次性无菌注射器，从鱼臀鳍附近45°进针至鱼脊柱骨，退针2～3毫米（图1）；心脏采血:采用一次性无菌注射器，在心脏处垂直进针。C.血液收集于添加抗凝剂肝素钠的血液收集管中（图2）；

图1 鲫鱼尾静脉采血

A：尾静脉采血；B：尾静脉采血解剖部位图（尾静脉如箭头所示）

图2鲫鱼心脏采血

A：心脏采血；B：心脏采血解剖部位图（心脏如箭头所示）

血液涂片：

A. 准备：取载玻片一张，洗涤清洁后用擦镜纸擦干；B.涂片：用微吸管吸取一小滴血液，置于约占3/4的位置上，另外用一块载玻片，用右手握着，与放有血滴的载玻片的血液前面接触，约成30度角倾斜，然后将血滴向前轻轻推移（图3）；C. 干燥：将玻片中涂有血液的一面向下，稍微倾斜放置，在空气中干燥；D.染色：用小滴管将瑞氏染液滴于涂片上，并盖满涂片部分固定约30 S，用姬姆萨对血涂片进行染色，室温条件下静置5～10 min；E.冲洗：用蒸馏水冲洗染液，冲洗后斜置血涂片于空气中干燥，或先用滤纸吸取水分迅速干燥，即可镜检。F.观察：在血涂片上滴上松柏油，使用显微镜的油镜进行观察。

图3 制作血液涂片

2、鳃丝压片

鳃由鳃耙和鳃丝组成，重点观察是鳃丝。操作步骤（图4）：A.观察鳃盖是否张开，观察鳃盖内侧；B. 用镊子固定鳃盖边缘，用剪刀沿鳃盖底部剪开，观察鳃盖是否完整，有无异物附着，有无溃烂；C.待鳃部完全暴露后，观察鳃丝是否紧密完整，颜色是否鲜红，黏液分泌是否正常；D.取小部分鳃丝，置于载玻片上，在载玻片上滴加一滴蒸馏水，另取一盖玻片置于鳃丝上方，迅速挤压两载玻片，致病鳃压片，用于显微镜观察鳃部寄生虫（图5）。

图4 鳃的解剖观察

图5鳃丝压片

3、小瓜虫和指环虫观察

   将制作的压片在显微镜低倍镜下进行观察，比较小瓜虫和指环虫的形态特征。

4、锥体虫观察

   将制作的血涂片在显微镜低倍镜下进行观察，观察锥体虫的形态。

五、作业

1、绘制并比较小瓜虫和指环虫的形态特征。

2、绘制锥体虫的形态。

实验六  水霉的检测与培养（6学时）

一、实验目的：

1、了解并掌握水霉的形态特征。

2、掌握水霉培养基的制作及培养方法。

二、实验原理：

水霉是真菌的一属，属于鞭毛菌亚门，水霉科。生长在水中动植物或其遗体上，菌丝无隔而分枝。生长在水中动植物或其遗体上，菌丝无隔而分枝。有两种生殖方式：无性繁殖时，菌丝顶端膨大，产生横壁，形成游动孢子囊，产生双鞭毛的游动孢子；有性繁殖时，形成精子囊和卵囊，经过精子和卵的结合，形成卵孢子。

三、实验器具与材料

1、菌种：水霉培养后的培养物。

2、培养基：土豆琼脂培养基（PDA）、乳酸石炭酸棉兰染液、酒精、蒸馏水等。

3、仪器或其他用具：平皿，盖玻片，U形玻棒，解剖刀，20%的甘油以及显微镜等。

四、实验步骤

1、水霉的检测

  水霉一般寄生于鱼体表，成白色棉絮状，通过肉眼可以进行检测。

2、PDA培养基的配制

(1)、称量和熬煮：按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000 ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30 min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到1000 ml。

(2)、加热溶解把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g(提前搞碎)，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。

(3)、分装按实训要求，将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。

(4)、将配制好的培养基放入在高压蒸汽灭菌锅中，121℃，灭菌20min。去除培养基制作平板，冷却后放4℃冰箱备用。

3、水霉的培养

载玻片小室培养：

（1）、培养小室的灭菌：在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一U形玻棒（用两张盖玻片代替），其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，包扎后于121℃灭菌30min，烘干备用。

（2）、琼脂块的制作：取已灭菌的马铃薯琼脂培养基6-7ml注入另一块灭菌平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成0.5-1cm2的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上（每块放两片）。注意无菌操作。

（3）、接种：用尖细的接种环挑取很少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。接种量要少，尽可能将分散的孢子接种在琼脂块的边缘上，否则培养后菌丝过于稠密影响观察。

（4）、培养：现在平皿的滤纸上加3-5ml灭菌到20%的甘油（保持湿度），盖上平皿，28℃培养。

（5）、镜检：根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。

4、水霉的染色观察

（1）、在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液。

（2）、用镊子从生长有霉菌的斜面挑取霉菌菌丝

（3）、用50%的乙醇浸润，洗去脱落孢子再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下

（4）、放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。

（5）、盖上盖玻片（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片）。

（6）、镜检：先用低倍镜。再转换高倍镜镜检并记录观察结果。

五、作业

1、观察并绘制水霉菌丝及孢子形态。

2、描述水霉主要形态特征。

实验七 组织病理切片的制作与观察  （8学时）

一、实验目的

1、掌握组织病理切片技术和制备方法。

2、区别常见几种病理变化形态。

二、实验原理

1、技术原理

（1）切片制作的基本原理

组织切片技术是组织学、胚胎学、生理学、动物学等生物学科及病理解剖学医学科学，研究观察细胞，组织的生理，病理形态的一种主要方法，用以补充宏观的不足，因宏观观察不仅不易看清细胞，组织的微细结构，且操作复杂，但在经过固定，脱水，包埋等手续后就可以把材料切成极薄的片子，再用不同的染色方法，以显示不同细胞和组织的形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。切片也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。由于近代物理学、化学及生物学等学科的发展为组织切片方法提供了丰富的知识和条件。近代物理学的发展为组织切片技术提供了新的技术及设备，使组织切片的方法不断更新。

（2）染色的基本原理

A、物理作用

物理作用包括毛细管作用及渗透作用，吸收作用，吸附作用。通过这三种因素的一种或者全部，染料就能进入细胞或组织内。

B、化学作用

一个动物细胞内，一般有酸性和碱性部分的区别，含有酸性物质的部分它能与溶液中的阳离子结合。含有碱性部分的物质它能与溶液中的阴离子结合，如细胞核，一般认为是由酸性物质组成（核酸），故它和碱性染料的亲和力强，所以细胞核为碱性染料苏木紫所染，而胞浆中含碱性物质被酸性染料伊红所染。

染色的化学学说并认为蛋白质是两性物质，即在酸性溶液中呈现盐基性，带正电荷，能与带负电荷的离子结合，它在碱性溶液中呈酸性，带负电荷，能与带正电荷的离子化合。

三、实验器具与材料

 石蜡、切片刀、切片机、毛笔、HE染色液、载玻片、盖玻片、松柏油、显微镜、甲醛、包埋框、恒温箱

四、实验步骤

1、取材

取材时要求材料尽可能新鲜，由于鱼体组织的自溶速度与恒温动物组织比较要快得多必须迅速处置，免除标本发生变性。夏天不要超过2-4小时，冬天不要超过6-12小时，材料大小以1.5×1.5×0.5cm为宜。未固定材料，常因质软而造成切割困难，一般可取稍大材料（约2×2×1cm）与编号一起投入固定液中经6-12小时后，进行初步修整（厚度不要超过0.5cm为好），再继续固定6-12小时。取材时应注意，所取组织应包括各脏器的重要结构或全层。如去肾脏，应包括皮质、髓、和肾盂。有浆膜的器官如肝、脾、肺包括膜在内。病理材料，除切取病变部位外，还要切取病变和正常组织交界部分的区域，以利观察和分析。切取材料，到要锐利，用力轻而均匀，勿挤、扯，以免损伤组织。

管状器官一般横切，一些柔软或薄的材料如神经、肌腱、肠系膜等应先平摊与吸水纸上，在投入固定剂中，取材的同时，应加标签以区别，一般用卡片纸小条，用铅笔写上标本的名称和年、月、日。

2、固定

从鱼体取下之后立即投入固定剂内，借助化学药品的作用使细胞组织的形态结构保存起来，不使其改变形态和变质的一种手续。固定的作用和目的：（一）可以防止组织溶解及腐败；（二）使细胞内的糖、脂、朊沉淀和凝固，保持其原有的结构；（三）防止组织的自溶和细菌性腐败。组织材料与固定液之比为1:20左右。

几种常用的固定液

甲醛（Formeldehyde）：甲醛溶于水而得，最大溶解度约为40%，固定用为10%，即取40%甲醛溶液10ml，加水90ml即成。一般固定12-24小时。

任克（Zenker）氏液：

重铬酸钾   25g

升汞       5g

蒸馏水     100ml

醋酸       5ml

将重铬酸钾，升汞和水混合，加热溶解，冷后过滤贮存，临用时取该液95ml加醋酸5ml即成。经此液固定的组织胞浆核染色颇为清晰，固定小组织块需12-24小时，流水冲洗12-24小时。含升汞混合固定液固定组织层，产生许多汞盐沉淀沉积在组织中，应在脱水前或切片脱蜡层浸入0.5-1%碘酒精中20分钟至12小时去汞，再用5%硫代硫酸钠去碘。

注：用此固定液固定，组织块去汞常常不易去净，脱蜡去汞后，汞盐对切片又有影响，因此，可先将组织块去汞，脱蜡后再去一次，虽多一次手续，但效果良好。

波音（Bouin）氏液           Gendre氏液

   苦味酸饱和水溶液 75ml       95%酸性苦味酸饱和液 80ml

   40%甲醛溶       25ml       福尔马林             15ml

   冰醋酸            5ml        冰醋酸               5ml

此液渗透力强，对小块组织需固定数小时，组织收缩小而着色良好。苦味酸有软化皮肤角质特效，用于固定皮肤组织的最佳选择。固定层水洗12小时即可进行脱水（此液不影响染色效果）。

乙醇（Ethyl alcohol）

除少数特殊反应用作固定剂外，纯酒精可保存糖原，尿酸，色素等。一般都作为脱水剂。

3、水洗

组织固定后，均要进行水洗（除酒精作为固定剂之外），以除尽固定液，停止固定。一般水洗2-24小时。

4、脱水

组织经固定水洗而进行石蜡包埋前需经脱水手续，才能使包埋剂渗入。脱水剂的特点应该是它与水在任何比例下都能混合的液体。最常用的脱水剂是酒精和丙酮。

高浓度酒精对组织有强烈的收缩和脆化的缺点，因此，在以酒精为脱色剂时，应从低浓度开始，逐渐增加浓度慢慢去掉组织中的水分，这样可以避免组织过度收缩。一般从70%开始，经80%、95%，到100%，但有时为了某种特殊的需要，如防止糖原或尿酸盐结晶在水中消失，要直接投入无水酒精中固定兼脱水。

5、脱钙

鱼体组织脱钙用8%的甲酸蒸馏水溶液，每8-12小时更换一次，脱钙完后必须将组织转入10%酒精。

6、透明

石蜡与大多数脱水剂不能混合，都需要一种可以与脱水剂及石蜡二者相混合的媒介，这种媒介被称为“透明剂”。通常的透明剂有二甲苯、甲苯、氯仿等。组织块在透明剂中置放2-6小时即可。

7、浸蜡

将已脱水透明的组织块投入已熔化的石蜡液中，让石蜡渗透组织的过程。整个过程需在恒温箱中进行。石蜡必须完全处于液体状态，才能达到浸蜡的目的。

8、包埋

用过滤纯石蜡注入纸盒或铜制的包埋框中，用热镊子取出已浸好蜡的组织块，切面向下，平置于盒底，并轻轻压一下。如有多块组织，每块间距离隔1cm左右。即时放上标签，待表面冷凝后，放冷水中加速凝结。

包埋用石蜡，其熔点为50-64℃之间，依所包埋材料及室温高低而进行选择，夏秋季节，室温高，宜用58-64℃硬蜡，冬春季节以50-56℃为好。

9、蜡块修整

将已包埋冷凝后的蜡块，依组织块形状，将多余的石蜡切去，四周留少许蜡边，切面要求平整。

10、切片

将修好的蜡块及小木块，于底部分别加热，稍熔时迅速将蜡块紧贴在小木块上。冷后，将小木块固定在切片机的组织固定推进器上，调整机头，使组织切面与切片刀平行，调好切片厚度（一般5-7微米）。右手转动机轮，左手持毛笔，轻轻拨起切片，待切成一条蜡片带时，用小镊子夹住下一张蜡片，左手用毛笔托起蜡片的另一端，放在蜡片盒中。

11、附贴

取洁净的载玻片涂少许蛋白胶备用。

取蜡片一段，平置内盛温水（约40℃）的水浴锅内，切片随即展平，用弯头镊子将蜡节分成单张，将载玻片贴近蜡片，用镊子牵引至版片上，在慢慢托起。

12、烘烤

蜡片附贴至玻片层，应马上放入温箱中烤干水分，以防止在染色时脱落。

13、染色

A.        脱蜡

将已烤干的切片数张、置于盛二甲苯的染色缸内，2-5分钟，以去掉组织上的石蜡。

B.        去二甲苯

切片从二甲苯中取出，进入95%酒精1分钟，以洗去二甲苯，再投入95%、80%、70%各级酒精1分钟。从低浓度的酒精进入水中。

C.        水洗数次以去酒精

D.       用Harris氏苏木素液染色10-15分钟，室温低时，可延长染色时间。

E.        水洗剩余染料

F.         分化  过染胞核的苏木紫液，需经0.5%-1%的盐酸酒精进行分化，分化时间数秒至一分钟。水洗0.5-1小时，以去算并蓝化切片，如需急速染色，可用碱水促蓝（0.1%氨水或1%碳酸锂），但应用水充分洗涤，否则对伊红可能据染，如果不受时间限制，应以流水冲洗显蓝为佳。

G.       0.5%-1%伊红作对比染色，染2-5分钟，若着色过淡，可延长时间。

H.       水洗剩余染液，快速冲洗。

I.          脱水  用80%、95%、100%各级酒精，逐渐脱水，使切片不致急剧收缩。注意，酒精有脱水和褪色作用，在低浓度中，时间宜短，100%酒精中，要延长时间，使水彻底去净，不然影响透明。

J.          透明

置二甲苯中5-10分钟使切片清晰亮。如部分或全部出现去雾状，便是脱水不净，应退回午睡酒精中，在此脱水后，放回二甲苯透明，直至完全透明为止。

K.  封固

由二甲苯中取出切片，用细布或丝绸擦去组织周围的二甲苯，速加甲苯树胶一小滴于切片上，并用小镊子取一张洁净略大于组织的盖玻片，轻轻盖在切片上，滴胶时注意适量，过少不能盖过切片；过多从该片四周外溢难干且易污染，切片封固后，收放暗处或温箱中待干，以免盖片移位，便于外存。

14、显微镜观察

苏木紫伊红染色，显示细胞核呈蓝色，胞浆呈浅红色，肌纤维深红色，红血球橙色或红色。

15、结果判定

A.        淤血：红细胞出现在血管内大量淤积

B.        出血：红细胞出现在血管之外的部分

C.        坏死：细胞核溶解、碎裂

D.       增生：网状细胞或结缔组织增多

E.        变性：细胞颗粒变性：细胞浑浊，内有小颗粒样物质

     细胞空泡变性：细胞内出现大小不一的空泡，严重时整个细胞空泡，呈气球样变

     细胞脂肪变性：结合苏丹染色，细胞内出现圆形小空泡，或指环状细胞

     透明变性：血管壁周围或肾小管细胞内出现嗜伊红均质物质

五、作业

1、简要描述组织病理切片的制备步骤及原理。

2、绘图：淤血、出血、细胞坏死、细胞颗粒变性和细胞脂肪变性。

3、叙述细胞空泡变性和脂肪变性的区别和鉴别方法。

实验八  常用抗菌药物的MIC和MBC测定（6学时）

一、实验目的：

1、掌握MIC和MBC的测定方法。

2、了解中药煎剂制备方法。

二、实验原理：

体外抑菌试验主要用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长的效力和抗菌谱，常用的评价指标为最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。

最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）：在微生物鉴定的稀释法中以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度。

最小杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）：杀死99.9%（降低3个数量级）的供试微生物所需的最低药物浓度。

三、实验器具与材料

常用抗菌中药：板蓝根、大黄、黄柏、黄芩；水产用氟苯尼考和恩诺沙星粉（纯度>99%）。

嗜水气单胞菌，TSA和TSB培养基，试管，2ml离心管，量筒，移液器，枪头，生理盐水，烧杯，分光光度计，比色皿，生理盐水等。

四、实验步骤

1、煎剂制备：

称取中药，每种3.2g，分别加蒸馏水60mL，浸泡30min后，用酒精灯文火加热至100℃，持续加热30min后，药液用4层纱布过滤，药渣再加蒸馏水40mL，浸泡30min后，文火加热至100℃，30min，过滤，2次滤液合并浓缩至10mL。药的质量浓度为0.32g／ml，55.16kPa（110℃）高压灭菌20min，备用。

2、肉汤培养基制备：

使用营养肉汤（TSA），按10ml/种配制，共需120ml，实际配制150ml。

3、菌液制备：

菌株复壮（28℃，24h）后，取纯培养菌液，嗜水气单胞菌，用无菌肉汤或生理盐水制成1×105个/ml菌液备用，采用平板计数法计数。

4、药液制备：依次制备64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25mg/ml，最后一管为无药物对照。（以下为1ml终体积，若为2ml终体积则加倍计算）

采用试管连续倍比稀释法进行。取10个灭菌试管，往第1个试管中加肉汤1.6ml，其它9个试管各加肉汤1.0ml，于1号管中加入药液0.4ml，混匀。从1号管中吸取1.0 ml移至2号管中，混匀。再从2号管中吸取1.0ml移至3号管中，如此类推，进行倍比稀释至9号管中，最后吸取1.0ml弃去。10号管仅加1.0ml肉汤作对照。

1.0

0.4      1.0

 

1.6

分别称量恩诺沙星和氟苯尼考粉各0.01 g（实际含量），用适宜助溶剂溶解后，再用灭菌蒸馏水配制1mg/ml的恩诺沙星和氟苯尼考药液，现配现用。

5、定量接种受试菌株，测定MIC和MBC

向上述10管中分别加入1.0ml菌悬液，使细菌终浓度为0.5×10⁵个/ml，置于25~28℃ 恒温培养箱中培养，分别于24 h、48 h观察结果。

24 h时，若对照组细菌生长良好发生混浊，药液管亦发生混浊，既表示细菌生长，该浓度供试药物无抑菌作用；若试验组药液管清亮，表示细菌生长受到抑制，其为能够抑制细菌生长的最大稀释度的药液，既为该药物的最小抑菌浓度(MIC)。

继续培养至48 h，若药液管仍清亮，将清亮的药液肉汤各管接种于普通琼脂平板上，培养观察，仍无细菌生长的最小药物浓度即为该药物的最小杀菌浓度(MBC)。恩诺沙星和氟苯尼考粉作为化学药物对照，该对照每次课均应设置。

五、作业

1、记录不同药物对嗜水气单胞菌的MIC和MBC的浓度。

2、比较不同药物的抑菌或杀菌效果。

实验九  常用水产药物的急性毒性试验（12学时）

一、实验目的：

1、了解常见水产药物的急性毒性实验的原理。

2、掌握常见水产药物的急性毒性实验的方法。

二、实验原理：

随着我国水产养殖业的发展，集约化高密度养殖模式大面积推广，水产动物疾病也频频爆发。在水产动物疾病治疗中常用到一些化学药物，药物的使用剂量如果不准确往往会造成水产动物死亡。通过药物的急性毒性实验可以对药物的安全浓度进行检测，有利于指导用药。

在规定条件下，使鱼类接触含不同浓度药物的水溶液，以96h为一实验周 期，在24h、48h、72h和96h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50%时的受试物浓度，半数致死浓度用24h LC50、48h LC50、72h LC50和96h LC50表示，并记录无死亡的最大浓度和导致鱼类全部死亡的最小实验浓度。

三、实验器具与材料

健康鲫鱼（50g左右），硫酸铜（蓝色粉末或晶体），漂白粉（有效氯 30%），天平，水质试剂盒（溶氧、pH、氨氮、亚硝酸盐），水族箱，烧杯，玻璃棒，量筒等。

四、实验步骤

1、将实验鱼在室内水族箱暂养 7d，试验前停食1d，选择体质健壮、无伤病的个体进行试验。试验用水为曝气 24 h 的自来水，p H 值为 6.8～7.2，溶氧量5 mg /L以上。每个实验浓度组应至少设3个平行系列，每一系列设一个空白对照。每一浓度组及对照组至少使用10尾鱼。

2、药物配制：按照表1配制不同浓度的药液。

表1 药物配制浓度

药物	实验药物质量浓度（mg/L）
硫酸铜	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9
漂白粉	1.0	1.1	1.2	1.3	1.4

 

3、将不同浓度的药物配制好加入到水族箱中后开始计时。在实验开始后3h或6h观察各处理组鱼的状况，并记录实验鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去平衡，游泳能力和呼吸功能减弱，色素沉积等）。并且在实验24h、48h、72h和96h后检查受试鱼的状况，并做记录。如果受试鱼没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄后无反应，即可判断该鱼已死亡。观察并记录死鱼数目后，将死鱼从容器中取出。

4、半数致死量（LC₅₀）计算

寇氏法（Karber 氏法）：以浓度的常用对数为横坐标，死亡率的概率单位为纵坐标，通过回归方程，将24h、48h和96h的半致死浓度（LC₅₀）和95%的置信限采用寇氏法（Karber 氏法）求得：

lg LC₅₀=XK- C∑[Pi + P(i+1）]

式中： XK- 最大剂量的对数； C- 相邻剂量比值的对数； Pi、P(i+1）- 各剂量组的死亡率。LC₅₀的 95%可信限=lg(lgLC₅₀±1.96 SlgLC₅₀），其中 SlgLC₅₀=C{∑[Pi（1- Pi) ]}。

5、计算出不同药物的LC₅₀

依据LC₅₀值的大小，可以将化学物质的急性毒性分为剧毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5级，如实验表2所示。

表2 鱼类急性毒性实验毒性分级标准

鱼起始LC50（mg/L）	＜1	1～100	100～1000	1000～10000	＞10000
毒性分级	剧毒	高毒	中等毒	低毒	微毒（无毒）

 

五、作业

1、计算并比较硫酸铜和漂白粉的LC₅₀。

2、比较硫酸铜和漂白粉对鲫鱼的毒性大小。

实验十  常见商品渔药的识别与应用（4学时）

一、实验目的：

1、了解并认识商品渔药的种类。

2、掌握不同渔药的使用方法。

二、实验原理：

渔药按作用及用途可分为化学药、中药、生物制品等，根据药物的功效一般有：环境改良剂、消毒杀菌剂、抗微生物药、杀虫驱虫药、代谢改善和营养剂、

中草药、生物制品及其他辅助性药物等。

1、环境改良剂

以改良养殖水域环境为目的所使用的药物，包括底质改良剂、水质改良剂和生态条件改良剂。常用的环境改良剂有氧化钙（生石灰）、漂

白粉、光合细菌、沸石等。

2、消毒剂

以杀灭水体中的微生物（包括原生动物）为目的所使用的药物。常用的消毒剂有甲醛溶液（福尔马林）、氧化钙（生石灰）、氯化钠（食盐）、漂白粉、高锰酸钾、硫酸铜、硫酸亚铁等。

3、抗微生物药品

指通过内服或注射，杀灭或抑制体内微生物繁殖、生长的药物。包括抗菌药、抗真菌药、抗病毒药等。抗菌药又分为抗生素类，如青霉素；喹诺酮类，如氟哌酸（诺氟沙星）；磺胺类，如磺胺嘧啶；呋喃类，如呋喃唑酮（痢特灵）；抗菌增效剂，如甲氧苄氨嘧啶；其他，如喹乙醇。

4、杀虫驱虫药

指通过药浴或内服，杀死或驱除体外或体内寄生虫的药物以及杀灭水体中有害无脊椎动物的药物。包括抗原虫药，如硫酸铜、硫酸亚铁、碘等；抗蠕虫药如敌百虫、碳酸氢钠、氯化铜等；抗甲壳动物药如敌敌畏、高锰酸钾等。

5、代谢改善和强壮药

指以改善养殖对象机体代谢、增强机体体质、病后恢复、促进生长为目的而使用的药物。通常以饵料添加剂方式使用。

主要包括

（1）、维生素：可分为脂溶性维生素如维生素A和维生素D；水溶性维生素，如维生素B。

（2）、钙、磷及微量元素，如磷酸氢钙、磷酸二氢钠等。

（3）、氨基酸，如蛋氨酸、甘氨酸等。

6、中草药

指为防治水产动植物疾病或改善养殖对象健康为目的而使用的经加工或未经加工的药用植物，又称天然药物。根据中草药的作用可分为抗细菌中草药，如大黄、黄连、大青叶等；抗真菌中草药，如马篼铃、白头翁、苦参等；抗病毒中草药，如板蓝根、野菊等；驱（杀）虫中草药，如苦楝皮、使君子等。

7、生物制品和免疫激活剂

生物制品是指用微生物（细菌、噬菌体、病毒等）及其代谢产物、动物毒素或水生动物的血液及组织加工制成的产品，可用来预防、治疗或诊断特定的疾病。其中包括：抗毒、抗菌、抗病毒的抗病血清；供诊断各类特定疾病的诊断试剂（诊断液）；用于预防传染病发生的疫（菌）苗如草鱼出血病疫苗等。生物制品多为蛋白质，性质不太稳定，不般都怕热，怕光，有些还不可冻结。

免疫激活剂主要是促进机体免疫应答反应（包括特异性免疫应答与非特异性

的免疫应答反应等）的一类物质。该类物质大部分为无机化合物和有机化合物，

一般均为非生物制品。免疫激活剂按其作用机制可分为两类：一类是改变疫苗应

答的物质，促使疫苗产生、增强或延长免疫应答反应，称为佐剂。另一类是非特

异性的免疫激活剂，如多肽类，黄芪多糖，萄聚糖等。

三、实验器具与材料

不同公司商品渔药。

1、利洋水产：孢虫易克、鱼可舒、精制敌百虫粉、鳃肤康、炎肤康、氟多力、清塘修复安、永乐碘、醛立灭、银翘板蓝根散、肝胆易康、舒肤康、营养快线、利多精、爽水安、水中宝、底居安、优肽（稳定型）、EM波卡西。

2、通威三新药业：通威强壮散、肝胆舒灵、通威菌毒宁、通威菌清、通威指环清、通威止血散、通威多维、通威菌血止、通威增效鱼复康、通威底改（Ⅰ）、通威碧水灵。

3、科斯力达：利达解百纳、365解毒宝、有机酸精华液、鱼虾百毒康、百毒杀、二溴海因（力达）、倍力健、强效EM（力达）、产酶光合菌（力）、全能降解素、应激王（力达）、力补360、利达生命素、宝典、优乐美、纳米氧（力达）、降氨增氧降亚灵、水底爽、肝胆胰腺康（力达）、丁必净（力达）、解毒鳃康（力达）。

4、渔美康：水黄金、美康1号、优碘、重醛、弧菌抗1号、精品浓缩芽孢、微肥宝、源康清、蠕虫清、肥爽1号、菌美1号。

四、实验步骤

1、观察不同公司商品渔药的名称、有效成分、含量、用途、用法与用量。

2、对不同渔药进行分类，如消毒类、改底类、调水类、抗菌类、杀虫类、免疫增强类、抗应激类等。

3、比较不同公司同类药物的有效成分差别。

五、作业

1、描述五种不同类型商品渔药的名称、有效成分、含量、用途、用法与用量。

2、选择一个公司的渔药产品进行分类。

3、选择一类药物比较不同公司产品的有效成分含量、用途、用法及用量。

实验十一 细菌灭活苗的制备及免疫接种 （8学时）

一、实验目的

1、掌握细菌灭活苗的制备方法。

2、熟练疫苗的免疫接种技术。

二、实验原理

  灭活是指用物理或化学手段杀死病毒、细菌等，但是不损害它们体内有用抗原的方法，灭活的病毒具有抗原性，但失去感染力。甲醛由(即甲醛亚硫酸氢钠)在60℃以上分解释放出的一种物质，它无色，有刺激气味、易溶于水。35%～40%的甲醛水溶液俗称福尔马林，具有防腐杀菌性能，可用来浸制生物标本，给种子消毒等。甲醛可使微生物的蛋白质和核酸变性，导致其死亡，但不明显影响其免疫原性。因此甲醛又可作用细菌和病毒的化学灭活剂，用于疫苗的制备。

三、实验器具与材料

1、实验动物

健康无病黄颡鱼：体重80±5g，试验前驯养一周随机分为2组，免疫组和对照组，每组各20尾。

2、实验菌株

爱德华氏菌：由内江师范学院生命科学院重点实验室提供。

四、实验步骤

1、全菌灭活苗制备

将爱德华氏菌接种到脑心浸液琼脂平板，37℃培养24h后，用无菌生理盐水洗下，将洗下的菌液，接种到无菌脑心浸液肉汤，于恒温水浴振荡器，37℃，110r/min，振荡培养24h。采用平板稀释法进行细菌计数后，按体积比的6‰添加甲醛，并于恒温水浴振荡器中灭活，37℃，110r/min，振荡36h～48h。取制备好的全菌灭活菌苗少量接种于BHI固体培养基、BHI液体培养基，37℃培养48h，检测有无细菌生长。制得的全菌灭活苗可直接用于腹腔注射免疫及浸泡免疫。

2、菌苗的储藏

制备好的安全的菌苗可在阴凉干燥的室温下保存，但若较长时间保存则置4℃保存，菌苗有效期为4～6周。

3、免疫接种

免疫组的斑点叉尾鮰在免疫接种前，停食12h。按上述分组情况在第0周对斑点叉尾鮰进行首次免疫，于第2周，按相同剂量加强免疫一次。在第1周、3周、5周、7周和13周分别从各组中随机捞取5尾供试鱼，尾静脉无菌采取血液0.5～1mL/管，每组3管，采血后的斑点叉尾鮰放回原养殖池。所采集的血室温下静置lh，然后在4℃冰箱中保持4h后，于4℃条件下以4000r/min离心l0min，收集上层血清。

4、免疫效果评价

（1）、抗体效价测定

   收集的血清，至于-20℃冷冻保存，用于后续血清效价测定。

（2）、免疫保护率测定

首次免疫后第6周进行免疫保护率测定。保护率试验采用50LD₅₀的爱德华氏菌肉汤进行活菌攻毒，均按0.2mL/尾，腹腔注射，试验水温恒定在30℃。统计14d内各组鱼的感染和死亡情况。并按照下列公式计算相对免疫保护率：

RPS（%）=（对照组死亡率-实验组死亡率）/对照组死亡率×100%

五、作业

1、简述甲醛灭活苗制备的原理。

2、绘制尾静脉采血处的血管分布，分析尾静脉采血注意事项。

3、简述腹腔注射的注意事项。

实验十二 琼脂糖扩散和玻片凝集法检测血清中的抗体效价（8学时）

一、   实验目的

1. 掌握琼脂扩散法测定血清中的抗体效价的操作步骤。

2. 掌握玻片凝集法测定测定血清中的抗体效价的操作步骤。

二、   实验原理

琼脂糖扩散法：1%琼脂凝胶孔径约85nm，能允许抗原抗体在其中自由扩散，并由近及远形成浓度梯度，二者在比例适当处相遇，发生沉淀反应，形成白色沉淀带，沉淀带一经形成，即可判定抗体效价。

玻片凝集法：颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素

三、   实验器具与材料

1、实验材料

（1）免疫后斑点叉尾鮰待检血清，斑点叉尾鮰爱德华氏菌阳性血清,爱德华氏菌诊断抗原, 无菌生理盐水

（2）1%灭菌普通琼脂平板若干，湿盒，棉花，EP管（或灭菌试管）若干，EP管用U形塑料管架（8*12孔）

2、实验器具

打孔器，微量加样枪，加样枪枪头等

四、   实验步骤

1、琼脂扩散试验测定血清抗体

（1）、无菌操作台中将待检血清做不同稀释度的稀释，备用。

①取10支无菌EP管，排列在试管架上，按顺序标号1～10。

②用移液枪吸取无菌生理盐水，每只EP管内各加0.5 mL。

③用移液枪加0.5 mL鱼免疫血清于第1支EP管内，混匀。

④从第1管吸0.5 mL稀释免疫血清注入第2管，同样混匀，再从第2管吸取0.5mL注入第3管，以此类推至第10管，混匀后自第10管吸出0.5mL弃去。这样从1～10支EP管内血清的稀释度为2，4，8，16，32，64，128，256，512和1024。

（2）、将琼脂板打成梅花形孔（6空，中间还有一孔），直径约5㎜，孔距4㎜。

（3）、中间孔加标准爱德华氏菌诊断抗原，一孔加标准斑点叉尾鮰阳性抗体作为对照，周围孔加入不同稀释度的待检抗体。

（4）、置于湿盒，24-48小时观察结果。

（5）、结果判断

中央孔与周围孔之间出现沉淀线，即为阳性。当发现无沉淀线孔，即为阴性。

2、凝集实验的测定血清抗体

（1）、菌液制备

挑取甘油保菌的爱德华氏菌于无菌脑心浸液肉汤，于恒温水浴振荡器，37℃，110r/ min，振荡培养24h。革兰氏染色，检验细菌纯粹后，4℃保存备用。

（2）、Mcfarland比浊法

采用McFarland 比浊法估计上述菌液的细菌浓度（表1），用无菌生理盐水稀释，调整菌液浓度为为10⁸ cfu/mL。

表1 McFarland 比浊法估计细菌浓度

试 管 号	1	2	3	4	5	6	7	8
1%BaCL2	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8
1%H2SO4	9.9	9.8	9.7	9.6	9.5	9.4	9.3	9.2
相当每mL的细菌数	3亿	6亿	9亿	12亿	15亿	18亿	21亿	24亿

（3）、玻片凝集试验步骤

①取10支无菌EP管，排列在试管架上，按顺序标号1～10。

②用移液枪吸取无菌生理盐水，每只EP管内各加0.5 mL。

③用移液枪加0.5 mL鱼免疫血清于第1支EP管内，混匀。

④从第1管吸0.5 mL稀释免疫血清注入第2管，同样混匀，再从第2管吸取0.5mL注入第3管，以此类推至第10管，混匀后自第10管吸出0.5mL弃去。这样从1～10支EP管内血清的稀释度为2，4，8，16，32，64，128，256，512和1024。

⑤取清洁、干燥玻片5张，每张玻片分别用蜡笔划为三格，并依次编号1～13。

⑥吸取未稀释血清25 μL于1号格，两倍稀释血清25 μL于2号格，4倍稀释血清25 μL于3号格，以此类推至第11格，第12格加入25 μL阴性血清，第13格加25 μL生理盐水作为对照。

⑦每格加入上述制备的细菌菌液25 μL。

⑧轻轻摇动玻片，置于28℃烘箱，孵育5分钟后，再于室温放置5～10分钟。

⑨观察结果：

a.肉眼观察，出现乳白色呈点状散在的絮状物或凝集块者，即为阳性反应；仍为均匀的乳浊液者，即为阴性反应；
    b.低倍显微镜观察，阳性反应血清可见明显凝集块，阴性反应血清则无；

c.以“++++、+++、++、+”分别表示凝集强度，不凝集者记以“－”；

d.以血清最高稀释度仍能出现“+”凝集现象者，作为该免疫血清的效价。

五、作业

1、阐述琼脂糖扩散法和玻片凝集法测定血清中抗体效价优缺点。

2、区别琼脂糖扩散法和玻片凝集法测定血清中抗体效价的适用范围。

 

实验十三 间接ELSIA测定血清中的抗体效价（8学时）

一、实验目的

1、掌握ELISA方法的原理。

2、掌握ELISA 的操作方法与注意事项。

二、实验原理

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

三、实验器具与材料

1、实验材料

免疫后斑点叉尾鮰待检血清，斑点叉尾鮰爱德华氏菌阳性血清,爱德华氏菌诊断抗原, 无菌生理盐水，兔抗斑点叉尾鮰IgG，HRP标记的羊抗兔IgG，可溶性单组份TMB底物溶液等。

2、器材

聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器、塑料滴头、小毛巾、洗涤瓶、小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

3、ELISA相关试剂制：

（1）、包被液（现配现用）：Na₂CO₃ ，1.59g；NaHCO ₃ ，2.93g；溶解于1L蒸馏水中，调节pH至9.6。

（2）、PBS：0.02M磷酸盐，0.15MNaCl；NaH₂PO₄.2H₂O，0.876g；Na₂HPO₄.2H₂O，  2.56g；NaCl ，8.77g；溶解于1L蒸馏水中，调节pH至7.3。

（3）、洗涤液（×10）（低盐）：tris base，24.2g；NaCl，282.2g；硫柳汞，1g；吐温，5ml；溶解于1L蒸馏水中，调节pH至7.3。

（4）、洗涤液（×10）（高盐）：tris base，24.2g；NaCl，292.2g；硫柳汞，1g；吐温，10ml；溶解于1L蒸馏水中，调节pH至7.7。

（5）、抗体缓冲液：BSA，1g；加入至100mlPBS中。

（6）、封闭液：BSA，1g；加入100ml低盐缓冲液中。

（7）、底物缓冲液（柠檬酸盐缓冲液）：柠檬酸，21.0g；乙酸钠，8.2g；溶解于1L蒸馏水中。用NaOH调节PH至5.4。使用时，每15ml缓冲液中加入5ulH₂O₂

（8）、底物：（TMB）（42mM）溶解于1：2 柠檬酸：蒸馏水中。加入150ul该液体于15ml底物缓冲液。

（9）、终止液：2M H₂SO₄：向178.3 mL蒸馏水中逐滴加入21.7 mL 98 %H₂SO₄

四、实验步骤

1、细菌的包被：

（1）、将96孔板用含0.05%的多聚赖氨酸包被液包被。每孔50ul，60min；

（2）、用低盐洗涤液洗涤96孔板2次；

（3）、用PBS调节菌体浓度为1×10⁸，加入96孔板中，100ul/孔。4℃包被过夜；

（4）、每孔加入50ul，0.05%PBS稀释的戊二醛，孵育20min，28℃。

2、余下步骤：

（1）、用低盐洗涤液洗涤96孔板3次

（2）、用1%的小牛血清（BSA）封闭。250ul每孔，37℃孵育2h

（3）、用低盐洗涤液洗涤96孔板3次

（4）、用PBS倍比稀释鱼血清，运用2倍稀释的阴性血清和PBS为阴性对照。血清和对照组分别加入96孔板中，每孔100ul，28℃孵育3h，或4℃过夜。

（5）、用高盐洗涤液洗涤96孔板5次，最后一次孵育5min

（6）、向孔中加入抗鱼血清，100ul/孔，28℃孵育60min

（7）、用高盐洗涤液洗涤96孔板5次，最后一次孵育5min

（8）、向孔中加入稀释的鼠抗IgG-HRP（封闭液按1：1000稀释），100ul/孔。28℃孵育60min

（9）、用高盐洗涤液洗涤96孔板5次，最后一次孵育5min。

（10）、加入100ul/孔染液，28℃孵育5min

（11）、终止反应：向孔中加入50ul/孔的终止液

（12）、在450nm下记录结果。空孔运用染液和终止液填满。

五、作业

1、比较ELSIA法在检测血清抗体效价中的优点。

2、分析直接、间接、双抗夹心ELSIA的优缺点及各自的使用范围。

3、分析ELISA实验中的注意事项。

 

版块六：水族科学实践

 

实验一  常见观赏鱼的品种识别与评鉴（6学时）

 一、实验目的：

1、通过对金鱼和锦鲤的观察了解其形态特征，掌握其分类标准和命名原则。

2、通过对一些常见淡水热带观赏鱼的观察，了解其形态特征，加深对淡水热带观赏鱼的认识。

二、实验原理：

1、不同品种金鱼形态特征和各部分变异不相同，金鱼的系统命名即是根据鱼体各部分变异特点而命名。 

2、淡水热带鱼种类繁多，每一类的一些代表品种能较好地代表该类热带鱼的主要特征。

三、实验器具与材料 

    不同品种的金鱼（狮头、龙睛、水泡眼、鎏金、兰寿、蝶尾）已买 ，不同品种的热带观赏鱼：孔雀鱼（三个品种，雌雄各5条）、玛丽（白、黄、黑，雌雄各5条）、月光鱼（雌雄各5条）、剑尾鱼（苹果剑、鸳鸯剑、红剑，雌雄各5条）、丽丽鱼（两对）、珍珠马甲鱼（两对）、泰国斗鱼（半月和将军，雄鱼已买）、蓝虎皮鱼（5对）、玫瑰鲫（5对）、刚果扯旗（2对）、七彩凤凰（2对）。

四、实验步骤 

（一）金鱼品种的识别及赏析

1、观察不同金鱼的体态和体型（体细长而侧扁、椭圆或纺锤形、肥圆呈球形等。 ）

2、观察不同金鱼的头形（平头、高头、狮头） 

3、观察不同金鱼的体色（纯色、双色、五花等） 

4、观察不同金鱼的鳍形（有无背鳍、胸鳍长或短、尾鳍鳍形和长短） 

5、观察不同金鱼的鳞片（正常、珍珠、透明） 

6、观察不同金鱼的眼（龙睛、望天、水泡、正常、蛤蟆头眼） 

7、观察不同金鱼的鼻（有无绒球） 

8、观察不同金鱼的鳃盖（正常、外翻）

9、观察不同的锦鲤的姿态、色彩、斑纹。 

10、根据金鱼各部分的变异特点用系统命名法对金鱼进行命名。 

（二）热带观赏品种的识别及赏析

1、鳉形目胎鳉类常见观赏鱼的观察： 

1.1代表种：孔雀鱼、珍珠玛丽、球玛丽、月光鱼、剑尾鱼 

1.2共同特点：背鳍位于臀鳍上方雄性臀鳍前部鳍条显著长于后部，变成交接器。 

2、鲈形目攀鲈亚目常见种类的观察：

2.1代表种：泰国斗鱼、丽丽鱼、接吻鱼、曼龙鱼、珍珠马甲鱼 、泰国斗鱼

2.2共同特点：具有鳃上器官；背鳍、腹鳍、臀鳍均有鳍棘。 

3、鲈形目丽鱼科（慈鲷科）常见种类的观察： 

3.1代表种：神仙鱼、七彩神仙鱼、地图鱼、七彩凤凰、红宝石、血鹦鹉、蓝肚凤凰，各种短鲷 

3.2共同特点：左右下颌骨愈合；侧线中断为二，圆鳞，背鳍、腹鳍、臀鳍均有鳍棘。

 4、鲶形目和鲤形目鳅科常见种类的观察： 

4.1代表种：玻璃鲶、向天鼠、爬岩鳅、清道夫、皇冠泥鳅、蛇仔鱼、清苔鼠

 4.2共同特点：无鱼鳞，常有斑纹，某些种类身体上有盔甲状的骨板或骨棱，多有须。

 5、脂鲤目脂鲤科常见种类的观察： 

5.1代表种：红绿灯、头尾灯、柠檬灯、玫瑰扯旗、刚果扯旗、红光管鱼、黑十字鱼、红鼻剪刀鱼、黑裙鱼、彩裙鱼、红鼻鱼、铅笔鱼、企鹅鱼 

5.2共同特点：有脂背鳍，体形多样，色泽多样。 

6、鲤形目鲤科常见种类的观察： 

6.1代表种：虎皮鱼、斑马鱼、三角鲫、玫瑰鲫、银鲨、红尾黑鲨、白云山金丝鱼、T字鲫 

6.2共同特点：多具平滑的鳞片，单条侧线，体型以纺锤形为主。 

7、其他热带观赏鱼 代表种：七星刀、玻璃拉拉、珍珠虹、大眼鲳、银龙鱼、红龙鱼、金龙鱼

五、作业 

1、描述不同品种金鱼和锦鲤的外部形态特征，用系统命名法对金鱼进行命名。

2、描述所观察到的各种热带观赏鱼的特征。

   实验二 常见观赏鱼的雌雄鉴别（3学时） 

一、实验目的：了解和熟悉不同品种观赏鱼的雌雄区别。 

二、实验原理：多数观赏鱼雌雄之间在体形、色彩等方面存在或多或少的差异，特别是在繁殖季节两者之间差异尢为明显。

三、实验器具与材料 

水族箱、不同品种观赏鱼雌雄鱼（金鱼、孔雀鱼、红剑、曼龙)

四、实验步骤 

1、金鱼的雌雄鉴别： 雌鱼：体短而粗，后腹部膨大；胸鳍宽而圆；泄殖孔稍大而圆，呈梨形，微向外凸出，手摸较软；繁殖期游动较慢，反应不如雄鱼灵敏。 雄鱼：体瘦而长；胸鳍长而窄且尖，繁殖季节其第一鳍条和鳃盖上有追星，繁殖季节过后消失；泄殖孔小而狭长，呈瘦枣核形，两端尖，中间微膨大，与体表平或稍向内凹，手摸较硬；繁殖期游动活泼，常主动追逐其他金鱼。 

2、卵胎生鱼类雌雄鉴别：雌鱼：通常体较粗大，臀鳍圆形，腹部膨大，有些种类在生殖前在腹部肛门前形成黑斑。 雄鱼：通常体瘦小而色泽鲜艳，臀鳍尖而成交接器。

3、鲤科鱼类雌雄鉴别： 雌鱼：体色较暗，不鲜艳，繁殖期腹部膨大。 雄鱼：体较细长而瘦，腹部不膨大，体色鲜艳，在繁殖期有较强的婚姻色。 

4、脂鲤科鱼类的雌雄鉴别： 雌鱼：一般体较粗壮，腹部膨大，体色暗于雄鱼。 雄鱼：体多细长，背鳍、臀鳍和尾鳍长于雌鱼。 

5、丽鱼科鱼类雌雄鉴别： 丽鱼科一般较难鉴别雌雄，且社会性极强，种间和性间排斥性强，一般会自由配组繁殖，人为配组则效果往往不好。

6、斗鱼科鱼类雌雄鉴别 雌鱼：体多小于雄鱼，体色较浅，背鳍一般较短，末端圆。 雄鱼：体多大于雌鱼，体色较鲜艳，繁殖季节颜色尤为鲜艳，背鳍较长而末端稍尖。

 五、作业  

撰写调查报告，分析其存在的问题和不足，

实验三  卵胎生鱼类的人工繁殖及幼苗培育 （9学时）

一、实验目的：掌握卵胎生鱼类的繁殖方法；掌握卵胎生鱼类的幼鱼培育过程和方法。

二、实验原理：卵胎生鱼类的繁殖特点是体内受精，雌鱼直接产下幼鱼，在群养下可以自然交配。卵胎生鱼类刚产出的幼鱼个体较大，具有游动能力和摄食能力，在此时投喂适口的饵料可以较容易地培育成功。

三、实验器具和材料  

卵胎生鱼雌雄亲鱼（孔雀鱼、红剑、玛丽）、亲鱼缸、产仔缸、仔鱼缸、抄网、浮游植物网、浮游动物网、200目筛绢、仔鱼培育缸及配套装置、水管、商品饵料、鸡蛋黄 

四、实验步骤

（一） 胎生鱼类的人工繁殖

1、亲鱼培育：将一定数量的雌雄亲鱼混合饲养于同一水族箱中，每天投给优质的饵料以促进亲鱼性腺成熟。

2、亲鱼交配：雌雄亲鱼混养（可自由交配）或配对，亲鱼性成熟后雄鱼经常追逐雌鱼，雌鱼腹部日渐膨大，肛门前的腹部出现黑斑说明雌鱼已受孕，此时加强投喂动物性活饵料。 

3、亲鱼移缸：当发现雌鱼腹部膨大如鼓、向腹部两侧突出，肛门处黑色胎斑变大、黑色明显加深时即接近产期，应移入产仔缸中。待产期间仍要投喂。

4、增加隔离措施：为防止亲鱼吞食产出的仔鱼，可在产仔缸内设置隔离墙或将亲鱼放入较大而种植有水草的缸中待产。 

5、亲鱼产后恢复：雌亲鱼产后体质衰弱，应单独饲养，待体质恢复后再与雄鱼合缸。 

（二） 胎生鱼类的幼苗培育

1、生物饵料捕捞： 灰水类：也叫洄水或纤毛虫，是多各轮虫和草履虫等微小浮游生物的统称，在水中大量聚集时如灰雾一般漂动，特别适合饲喂细小的仔鱼，作为初孵仔鱼的开口饵料，用浮游植物网在有灰水的水体中捞取。 水蚤类：即枝角类，大小一毫米左右，也叫鱼虫、青蹦、红虫，适于作为较大仔鱼或小型观赏鱼的饵料，可用浮游动物网在水蚤密集的小池塘等捞取，一般在黎明时分水蚤会因缺氧而密集地浮于水面。

2、生物饵料的处理：刚采集的生物饵料可能带有病原菌，要经多次漂洗后才能用，再用200目筛绢过滤浓缩。

3、饵料投喂：一般在仔鱼产出的第二天就进行投喂，一般用吸管吸入浓缩的灰水滴入仔鱼缸中，一日数次，每次投喂量宜少，饲喂后仍能保持水质的透明度，当仔鱼腹部鼓起才算饲喂合适。随仔鱼生长可开始投喂水蚤。（天然饵料缺乏时也可投喂人工代用饵料，使用为蛋黄或将商品饵料磨碎后使用）

4、水质控制：换水时注意换水前后水质的一致性和温度的一致性。给仔鱼换水时应用虹吸管先吸除多余的老水，使仔鱼密集于缸底，再连水轻轻舀出仔鱼入备有新水的缸中，原则上要示不能全缸换水，可将原水抽出2/3。再加进水质相同、水温相同的新水。

5、温度控制：理论上应保持恒温，尽量做到温度的稳定。

6、充气的控制：为仔鱼提供的气流应微小而细腻。 

7、分缸：随仔鱼生长，仔鱼缸日渐拥挤时应将同一缸中仔鱼进行分缸饲养。

五、作业 

写出实验过程和结果，并分析。  

 

实验四  水族箱设计及设备调试（4学时） 

一、实验目的：了解常规水族箱的设计、水族设备的安装方式和调试技术。

二、实验原理：水族箱造型多种多样，不同的外形可以配合不同的水族景观设计，更好的衬托景色的观赏效果。另外，水族箱注水后内外的水压差对玻璃片厚度，粘连的紧密度有一定的要求。 

三、实验器具与材料 

40*40方形玻璃块，玻璃刀、玻璃胶、玻璃胶枪、透明胶带、加热棒、增氧水泵，水族景观灯、电源插座。

四、实验步骤 

1、设计水族箱样式

根据造景的预期目的，设计适合的水族箱造型，可以是正方形、长方形、异形玻璃缸等。

2、玻璃片的裁剪和黏贴

根据设计，用玻璃刀将标准的玻璃片裁剪成所需规格和形状。寻找平坦桌面，首先放置垫底玻璃片，四周黏贴透明胶带，然后依次取四片侧面玻璃片，通过透明胶带固定在垫底玻璃片上。最后，使用玻璃枪在连接处均匀打上玻璃胶，避免气孔出现，完成后，从箱体外侧用透明胶进行进一步固定，待胶体凝固即可，所需时间根据温度，环境等情况而定。

3、水族设备安装

加注新水，在过程中检查箱体是否漏水。若注水完成后无漏水，再根据箱体设计依次安放加热棒、观赏灯及增氧水泵等设施。插上电源，调试设备运行情况，同时根据具体情况，调节设备位置。

4、维护

将水族箱及其设备持续运行一天以上，在此期间，检测箱体是否漏水，调节观赏灯光强弱，以及加热棒、水温计、增氧水泵等设备是否正常运行。

五、作业 

撰写设计和安装报告，找出水族箱安装及设备调试的注意事项并提出相关的建议和对策。

 

实验五  水族景观设计及维护（6学时） 

一、实验目的

了解水族景观设计原理，掌握设计技巧和安装步骤，以及后期的维护工作。

二、实验原理

水族景观常见设计原理的运用，主要包括多样性和统一的结合、协调与对比的结合、节奏与韵律的结合，最后通过层次感将各设计原理统一到水族景观设计中。 

三、实验器具与材料 

观赏水族生物（金鱼、锦鲤、热带观赏鱼、观赏龟、观赏水草等），水族观赏置景材料（山石、底砂、人物、建筑、沉木等天然人工或制品），剪刀，镊子，水草基肥。

四、实验步骤 

1、水族景观的设计

查阅资料，根据基本水族造景原理、实验基础条件、自身爱好等设计具备个人风格的水族景观，并在图纸中规划出观赏水族生物种类、观赏置景材料种类、水族辅助设备种类及其安放位置。

2、材料购买

根据设计蓝图，去水族观赏市场寻找和购买所需水族生物和置景材料，同时结合市场实际供需条件调整景观设计图。

3、水族箱置景

（1）对水族箱加注新水，检查箱体是否漏水，若无，则抽走箱内水体，继续以下步骤。

（2）铺放基层底砂，运用工具整理底砂的造型，添加水草基肥。

（3）堆放置景石，调节石群的稳定性，防止塌落

（4）向箱内加注部分新水，为下一步造景做准备，切忌不可将水加满和破坏底砂造型。

（5）根据设计蓝图，依序种植水草，并加以修剪，体现自身特点。同时结合进程，加满新水，安放辅助设备，并运行一段时间，待水质清澈后进行下一步作业。

（6）放入小型鱼类进行一段时间的试水，若无问题，在放入设计所需的观赏水生动物。

（7）将水族箱持续运行几天，期间定时进行观察和维护，如水质的测定，水草的修剪，对置景材料的种类和位置进行调节和固定。

五、作业 

撰写景观设计和置景报告，主要分析置景原理的运用和安装维护过程中的注意事项。

实验六  水族景观鉴赏与品评（2学时）

一、实验目的

   熟练运用景观设计原理和技巧的基本知识，对已设计好的景观进行鉴赏和点评，同时给出参考意见。

二、实验原理

水族造景设计原理和技巧，主要包括多样性和统一的结合、协调与对比的结合、节奏与韵律的结合，层次感的结合。

三、实验器具和材料

已设计完成的水族景观作品。

四、实验步骤

1、水族景观作品的观察和记录

   独自对已有的水族景观作品进行仔细观察，对每一项作品的设计原理、技巧、特点、展现出的风格进行详细的描述

2、集体研究讨论

   根据分组情况，集中组员对作品的描述，小组进行讨论，统一意见，对每一项作品的原理、技巧、特色和风格做出完整的鉴赏和品评报告，并根据标准进行评分。

3、班级研究讨论

   汇总各组的结果，对作品进行最终打分，班级公开对结果进行讨论，对其它组的结果进行点评。

五、作业 

撰写鉴赏和品评的结果报告，总结个人点评与集体品评的差异，分析产生差异的原因以及个人的保留意见。

实验七 内江市观赏鱼市场调查（6学时） 

一、实验目的：通过对内江市观赏鱼市场的消费特点、结构及观赏鱼的品

种、销售规模等进行详细调查，了解内江市观赏鱼市场经营与消费情况，认识常见的市售观赏鱼，掌握观赏鱼的主要分类特征。

二、实验原理：无 

三、实验器具与材料 

问卷打印

四、实验步骤 

1、调查方法

采用总体分层抽样和层内简单随机抽样相结合的方法，针对内江东兴区花鸟市场、市中区花鸟市场、市中区花鸟古玩市场等主要观赏鱼消费密集区，随机选取200名观赏鱼消费者和 20户店主进行实地问卷调查。

2、调查内容

2.1观赏鱼的销售特征

(1)观赏鱼主要销售品种及组成。

(2)观赏鱼来源地分布（原产地）

(3)销售规模与经营时间。

(4)销售旺季。

(5)销售渠道。

(6)经营状况。

2.2观赏鱼的消费特征

(1)消费者特征与消费目的。

(2)不同收入人群的单次消费价格。

(3)饲养时间。

(4)饲养经验。

(5)附加消费的认可度。

五、作业 

撰写调查报告，分析其存在的问题和不足，并提出相关的建议和对策。

 

 

版块七：综合实践

 

综合实践一：水产行业入门见习

一、基本信息

课程名称：水产行业入门见习

见习地点：1.四川省资阳市安岳县和平镇

          2.重庆市荣昌县石子镇

          3.四川省内江市市中区永安镇

          4.四川省内江市资中县银山镇

见习周期：1周

二、见习课程的目的与要求

目的：

见习活动立足于增加学生对水产行业的了解，使学生对水产行业发展前景有初步的认识，丰富了学生专业视野，提高学生对本专业的学习兴趣。由于该门课程在大一新生中开设，他们对具体的专业知识了解不多，这样可以让他们带着问题投入到以后的专业学习中，使他们的专业学习更具有针对性、目的性，同时提高他们学习专业知识的积极性。

要求：

1、根据见习内容查阅相关资料，对见习内容有初步了解，带着问题到现场学习和请教。

2、准备笔、笔记本、照相设备、录音设备，认真听取校外指导老师的讲解与答疑，做好相关记录，进行总结分析，完成见习报告。

三、见习内容

1、了解观赏鱼繁殖、养殖技术，了解观赏鱼养殖发展前景。

2、了解集约化流水养鱼的基本原理和必备条件，以及充分利用环境资源在我国的现实意义。

3、了解泥鳅新品种---台湾泥鳅养殖的基本技术，以及该品种在我国的发展前景，以及在国际出口上发展趋势。

4、现代综合农业在资源节约方面的实际意义和发展前景。

5、了解水产动物病害概况和行业动态以及细胞育种的应用前景。

四、见习时间进度安排

时间	地点	见习内容
第一天	观赏鱼永安养殖基地	内江观赏鱼养殖现状及发展前景
第二天	雅特水产安岳和平杨家基地	集约化流水养鱼基础条件和技术要求
第三天	鑫龙驰水产荣昌吴家基地	台湾泥鳅养殖现状和发展前景
第四天	农科院水研所银山基地	现代化农业产业园区观摩
第五天	内江师范学院	水产动物病害概况及行业动态 鱼类细胞工程育种研究进展及应用前景

注：具体时间视见习单位实际情况酌情调整。

五、见习安全管理要求与措施

1、整个见习期间，学生必须服从带队教师的活动安排，一切行动听指挥，保持集体行动，不允许任何脱离集体的私人行动，如探亲访友、提前离队回家等。
2、发扬集体主义精神，团结友爱、互相帮助，注意照顾体质差的同学和女同学。
3、服从见习基地工作人员的管理，不损坏公物（如有损坏，照价赔偿），任何情况下不得与任何人员发生任何矛盾和冲突，一切问题与带队教师联系后解决。
4、见习过程中注意安全，服从指挥，带队教师不允许去的危险地段坚决不去。禁止下河、到水库游泳。
5、爱护实训基地的一花一木，不污染环境。注意大学生个人形象，树立内江师院形象。
6、不准抽烟，注意防火，不准赌博，整个见习期间严禁饮酒。

六、见习成绩考核

1、见习结束一周内上交见习总结报告，要求字数2000字以上，图文并茂，纸质档和电子档各一份。内容要有一定深度，既有见习过程的记录和体会，又有见习问题的发现、探索与总结。

2、见习成绩评定：见习平时成绩50%+见习报告成绩50%

综合实践二：养殖环境生物学及鱼类学课程实习

一、基本信息

课程名称：养殖环境生物学及鱼类学

二、实习课程的目的与要求

目的：

1. 通过养殖水环境与鱼类学课程野外实习，使学生掌握长江上游流域自然与养殖水体中水生生物种类与分布情况；了解本地区自然水域和当地水产品市场中常见的鱼类、重要经济鱼类和珍稀保护鱼类的主要生物学性状，在实践中巩固所学到的鱼类学基础知识，使理论和实践结合起来，培养同学独立思考的能力以及创新能力。

2. 进一步熟悉和掌握各种水生生物生态调查的全部流程；掌握从野外水体中分离纯化重要饵料种类并进行保种和培养的技术；熟悉和掌握鱼类资源的常规调查方法。

3. 能够熟练使用各种水生生物的采样、处理等设备，正确进行定性与定量样品采集、固定、处理、计数；依据分类检索表，通过显微镜观察和简单的解剖鉴定常见的水生生物种类；能够依据鱼类形态特征识别生活中常见鱼类；掌握鱼类标本的制作技术，并了解本区域主要的渔具渔法及禁用渔具等。

4.进一步加深学生对水生生物与饵料生物学、鱼类学理论的理解，培养学生从事水产养殖业的职业情感与基本素质。

基本要求：

1．必须在实验前掌握课堂所学的理论知识，作好实验指导的预习，明确实验的目的要求；

2．充分发挥个人的主观能动性，态度严肃认真，亲手操作，掌握各种仪器的使用；

3．独立思考，分析研究，在规定的时间内按要求、细致准确地作好作业。作业不合格者，成绩不及格。

三、实习内容、要求和所用设备

实习编号：001

实习名称：重要饵料生物的纯化分离

实习内容：1.饵料生物样品的采集；

2.单细胞藻类如小球藻、栅藻的分离；

3.轮虫与枝角类的分离；

4.饵料生物的暂养。

实习要求：1.掌握饵料生物采集的方法；

2.掌握饵料生物分离的常用方法；

3.掌握饵料生物暂养的方法。

仪器与材料：25号浮游生物网、50mL塑料样品瓶、显微镜、解剖镜、凹玻片、台灯、毛细吸管、250mL锥形瓶、高压灭菌锅、光照培养箱、超净工作台。

操作与观察：1.浮游生物网采集饵料生物；

2.毛细吸管法分离单细胞藻类；

3.趋光法或毛细吸管法分离枝角类与轮虫；

4.藻类、轮虫与枝角类的培养液配置与暂养。

作业与思考：1.利用趋光法分离浮游动物的原理。

2.为什么不首选用趋光法分离栅藻和小球藻？

实习编号：002

实习名称：浮游生物样品的采集与处理

实习内容：1.浮游植物定性和定量样品采集与处理；

2.浮游动物定性和定量样品采集与处理。

实习要求：1.掌握浮游生物网、采水器、浮游生物沉淀器的正确使用方法；

2.掌握鲁哥试剂和甲醛的配置方法与使用量；

3.掌握每一种浮游生物样品采集的正确步骤。

仪器与材料：甲醛、滴管、碘化钾、碘、采水器、50mL样品瓶、1L样品瓶、浮游植物沉淀器、13号浮游生物网、25号浮游生物网。

操作与观察：1.鲁哥试剂的配置；

2.利用25号浮游生物网、采水器采集浮游植物、原生动物、轮虫

的定性和定量样品，并用鲁哥试剂固定。

3.利用13号浮游生物网、采水器和25号浮游生物网采集枝角类与

桡足类定性和定量样品并用甲醛溶液固定；

4.浮游植物、原生动物、轮虫定量样品的沉淀浓缩与收集。

作业与思考：1.描述采样过程并总结心得体会（如采样过程中的注意事项与常犯

            的错误）。

实习编号：003

实习名称：底栖生物样品的采集与处理

实习内容：底栖动物定性、定量样品的采集和固定。

实习要求：1.掌握抓斗式采泥器、分样筛的正确使用方法；

2.掌握底栖动物样品的采集与标本制作方法。

仪器与材料：抓斗式采泥器、40目分样筛、白瓷盘、光学显微镜、体式显微镜、镊子、酒精、甲醛、50mL样品瓶、载玻片。

操作与观察：1.抓斗式采泥器的使用与样品采集；

2.分样筛清洗底泥；

3.底栖动物的挑拣、分装与固定。

作业与思考：1.描述进行底栖动物采样的过程，并总结在采样中的心得体会（如注意事项，易犯的错误等）。

实习编号：004

实习名称：浮游生物装片的制作与种类鉴定

实习内容：1.显微镜的使用；

2.临时装片的制作；

3.浮游植物、浮游动物常见种类的识别与种属鉴定；

4.生物绘图的方法。

实习要求：1.了解显微镜的构造和成像原理；掌握显微镜的使用方法；

2.观察认识绿藻、硅藻和甲藻常见种类在光学显微镜下基本结构的特

征并初步掌握临时装片制作技术；

3.初步掌握生物绘图的基本方法。

仪器与材料：显微镜、载玻片、盖玻片、吸管、镊子、浮游植物定性样品。

操作与观察：1.显微镜的使用；

2.临时装片的制作；

3.藻类细胞的观察：如细胞壁、色素体、眼点、蛋白核、鞭毛、横

沟、纵沟等；

4.浮游动物观察：鞭毛、眼点、复眼、触角、胸肢等；

5.浮游生物显微图的绘制

作业与思考：1.绘制观察到的浮游生物，并标明各结构名称。

2.叙述上述浮游生物的特征。

实习编号：005

实习名称：底栖动物的种类鉴定

实习内容：1.常见软体动物的识别与鉴定；

2.常见甲壳动物的识别与鉴定；

3.水蚯蚓的识别与鉴定。

实习要求：1.识别并掌握常见软体动物的外形与结构特征。

2.识别并掌握常见甲壳动物的外形与结构特征。

3.识别并掌握常见水蚯蚓的外形与结构特征。

仪器与材料：软体动物、甲壳动物、水生昆虫与水蚯蚓活体、50mL样品瓶、甲醛、载玻片、放大镜、光学显微镜、体式显微镜。

操作与观察：1.软体动物的观察与测量；

2.甲壳动物的观察与测量；

3.水蚯蚓的观察与鉴定。

作业与思考：1.写出实验中观察到的水生底栖动物种类的特点。

实习编号：006

实习名称：常见鱼类捕捞工具的识别与使用

实习内容： 1 长江上游常见渔具名称、使用方法及其渔获物组成（见表1）。

       2 非法渔具。

1长江上游常见渔具及其主要渔获物

	渔  具  名  称					主要渔获物
类型	标准名称				俗 名
刺  网		定置单片刺网			条网、条子网、胶丝网	鲤鱼、鲫鱼、鲢、蛇鮈、铜鱼、圆口铜鱼、云南盘鮈、草鱼、黄颡鱼、翘嘴鲌、鲇、条等杂鱼。
		漂流单片刺网			条网、条子网、胶丝网、流网	沙鳅类、鲢、鲤、中华倒刺鲃、翘嘴鲌、铜鱼、圆口铜鱼、长鳍吻鮈、圆筒吻鮈
		定置三重刺网			站网或泡网	鲤鱼、草鱼、鲢、鳙、长吻鮠、鲶鱼、唇鱼骨、黄颡鱼、鳜鱼、翘嘴鲌、长鳍吻鮈、泉水鱼、蛇鮈等
		漂流三重刺网			三层流网、三层网	铜鱼、圆口铜鱼、长鳍吻鮈、吻鮈、圆筒吻鮈、长吻鮠、翘嘴鲌、蒙古鲌、草鱼、鳡、白甲鱼等。
围  网		双船无囊围网			围网	水库养殖鱼类，如鲢、鳙、草鱼、鲤、鳡等
拖  网		双船多囊拖网			百袋网、百袋子	鲤、鲫、沙鳅类、蛇鮈、黄颡鱼类、南方鲇、岩原鲤、副鳅等
地 拉 网		船布无囊地拉网			底拖网、拖网	水库池塘的各种养殖鱼类
		抛撒地拉网			拖网、苗种网	苗种培育池的各种养殖鱼类的苗种
张  网		双桩单片张网			拦河网	鲤、鲫、鲢、等
		双锚框架张网			壕子网	鲢、鳙、鲤鱼、餐、虾、黄颡鱼、鲇类、草鱼
敷  网		岸敷撑架敷网			罾网	鲇类、鲤、鲫、虾
		船敷撑架敷网			船罾网	圆口铜鱼、南方鲇、长吻鮠、吻鮈类的幼鱼，鳅鮀类、蛇鮈等
		定置延绳撑架敷网			抬网、银鱼网	黄颡鱼类、大鳍鳠、鳜鱼、银鱼等
		船敷箕状敷网				鲢、鳙、草鱼
抄  网		推移兜状抄网			大舀子、手抄网	鲢、鲤、翘嘴鲌等
掩  罩		抛撒掩网掩罩			手网、旋网	鲤、鲫、中华倒刺鲃、大口鲇、白甲鱼等
陷  阱		导陷建网陷阱			虾笼、地笼	虾、蟹，以及鲤、鲫、鳅类的各种幼鱼和小杂鱼等
		诱导插网陷阱			迷魂阵	鲤、鲫、、鲢、黄颡鱼类、蛇鮈、银鮈等多种鱼类，多达70余种。
钓  具		定置延绳真饵单钩钓具			小钩、排钩	黄颡鱼类、大口鲇、鲫、大鳍鳠、鳜鱼、铜鱼、圆口铜鱼等
		垂钓真饵单钩钓具			手竿，竿钓	鲤、鲫、草鱼、类
		垂钓真饵复钩钓具			手竿，竿钓	鲤、鲫、草鱼、类
		垂钓无饵复钩钓具			武斗钩	大口鲇
耙  刺		定置延绳滚钩耙刺			滚钩、滑钩、大钩等	大口鲇、长吻鮠、鲤鱼、草鱼、中华倒刺鲃等
龙  壶		散布倒须笼壶			鳝 笼	黄 鳝

 

实习要求：1了解长江上游鱼类常见的捕捞工具及其渔获物组成；

          2 了解长江上游鱼类非法捕捞工具。

仪器与材料：主要工具：记录表格、铅笔、相机等。

操作与观察：

          1 首先到当地渔具市场上熟悉鱼类捕捞工具的名称

          2 然后跟随渔民了解其作业方法和原理

作业与思考：试分析渔获物组成与捕捞工具之间的关联。

实习编号：007

实习名称：鱼类资源调查方法

实习内容：1 事前调查

      2 文献调查

      3 社会访问与调查

      4 现场调查

实习要求：

        1 做好鱼类资源调查的前期准备工作。

        2 掌握鱼类资源现场调查方法和注意事项。

仪器与材料：地图、记录表格、铅笔、参考书、鱼苗袋、相机。

操作与观察：1 首先确定鱼类资源调查的；

            2 查找调查区域类鱼类资源的历史资料范围；

            3 现场调查或捕捞。

作业与思考： 在进行鱼类资源现状调查时需要考虑哪些问题？

实习编号：008

实习名称：鱼类的形态学测定及种类鉴定

实习内容：1.可数性状测定：测量项目包括，全长﹑体长﹑体高﹑头长﹑吻长﹑

眼径﹑眼间距 ﹑尾柄长﹑尾柄高。计算出每尾鱼的体长/体高﹑体长

/头长﹑头长/吻长﹑头长/眼径﹑尾柄长/尾柄高以及其他有关的比例

性状；

2.可量性状测定：测量项目包括，鳍式﹑鳞式﹑鳃耙数﹑脊椎骨数等；

3.检索表的识别；

4.种类鉴定。

实习要求：1.了解鱼类的可量性状和可数性状；掌握相关性状的测量方法；

2.掌握检索表的使用方法，对照检索表初步对样品进行鉴定；

仪器与材料：镊子，解剖盒，直尺，分规等 材料：采集回来的鱼类标本。

操作与观察：1.首先对鱼类的可数、可量性状进行测定。

2.其次根据腹鳍位置﹑背鳍棘有无及鳞片为圆磷还是栉磷等情           

况，初步判断出大的类群；

3.最后根据详细观察的可量可数性状，参阅有关分类书籍，依次鉴定出所属目﹑科﹑属，鉴定到具体种时，要详细对照文献关于种的描述。

作业与思考：1.如何区分可量性状和可数性状？

2.以鲤科鱼类为例，将几个不同属编制成检索表。

实习编号：009

实习名称：鱼类浸泡标本的制作方法

实习内容：1 样品的采集

      2 标签的制作

          3 固定液的配制

      4 标本的室内整理

实习要求：

     1 掌握鱼类标签的制作方法和固定方法

     2 掌握固定液配制的方法。

仪器与材料：福尔马林（甲醛溶液）、标本箱、解剖40%盘、解剖刀、解剖剪、量杯、量筒、—注510  ml射器、纱布、白标布、铅笔、白线等等

操作与观察：1 标本的收集；

            2 标本的鉴定、标签的制作；

            3 固定液的配制和使用；

            4 泡制标本的整理。

作业与思考：写出鱼类泡制标本制作流程和注意事项。

实习编号：010

实习名称：鱼类繁殖生物学调查

实习内容：1 样品的采集

      2 实验方法

          3数据统计与分析

      4 结果与比较

实验要求：1.依据所学理论知识，科学设计实验方案。

          2.记录采样区域生境信息。

仪器与材料：电子天平、卷尺、福尔马林（甲醛溶液）、解剖40%盘、解剖刀、解剖剪、记录表等。

操作与观察：1 标本的收集；

            2 标本的解剖与测量；

            3 数据的统计与分析。

 作业与思考：以论文形式提供实验报告。

五、  实习报告

实习报告是实习过程的记录和体现，实习报告的内容应包括：实习日志、实验名称、目的、内容、主要仪器设备、操作步骤、实验结果、绘图说明、结果比较汇总与心得体会等。实习报告的书写是一项重要的基本技能训练。它不仅是对每次实验和整个实习的总结，更重要的是它可以初步地培养和训练学生的逻辑归纳能力、综合分析能力和文字和绘图表达能力。因此，要求参加实习的每位学生，均应及时认真地书写实习报告。要求内容实事求是，绘图清楚整洁，再配以相应的文字说明，分析全面具体，文字简练通顺。 

六、 实习考核

1、该课程为考查课。

2、具体考试办法：水生生物学与鱼类学分别进行考核，各占50%即50分。

（1）水生生物学考核由出勤率（满分5分）、采样方法考核（满分5分）、水生生物鉴定（满分5分）、实习报告（满分15分）、实习答辩（满分10分）、水生生物样品的数量与质量情况（满分10分）六部分组成。

（2）鱼类学考核由出勤率（满分5分）、鱼类标本识别（满分10分）、实习报告（满分15分）、实习答辩（满分10分）、鱼类标本的质量和数量情况（满分10分）五部分组成。

七、  使用教材及主要教学参考书

赵文. 2004. 水生生物学（水产饵料生物学）实验, 北京：中国农业出版社。

孟庆闻，李婉端，周碧云. 1993. 鱼类学实验指导，北京：中国农业出版社。

综合实践三：水产养殖生产实习

一、基本信息

课程名称：水产养殖生产实习

1. 实习地点：一线生产养殖基地

2. 实习时间：8周，每年的三月中旬至五月中旬。

二、实习课程的目的与要求

水产养殖生产实习是水产养殖专业的必修核心专业课程，也是一门应用性和操作性很强的课程。同学们在学习完该门课程理论知识后往往并不具备实际动手能力，要想培养出真正能够动手操作的应用型人才，必须加强鱼类增殖学实践课程的学习。

目的：

通过水产养殖生产实习，将鱼类增殖学中有关池塘清整、鱼类繁殖、苗种培育、成鱼养殖、水质管理、鱼病处理等关键理论知识运用到生产实践中，在生产实践中学会相关操作技能，巩固和加深所学习理论知识，培养独立工作和处理生产实践中应用问题的能力。

要求：

1、通过到相关生产单位生产实习，深入到养殖生产第一线进行观察和动手操作，获取直观的感性认识与客观的理性认识，了解和掌握以本专业为基础的生产实际现状和主要操作技能，巩固和加深已学的理论知识，为后续专业课的学习、课程设计、毕业设计打下基础。

2、在实习期间，把理论知识和生产实践相结合起来，拓宽知识面，提高工作适应能力，培养我们的发现、分析和解决问题的能力。

3、通过实习，广泛接触渔场管理人员、技术人员、工人、购买商，学会社交和开展群众工作，学习养殖技术人员的生产经验、技术革新和科研成果，学习他们在生产工作中各种操作技能和敬业奉献精神。

4、了解周围养殖水域的生产状况，进行对比分析。

三、实习内容

1、鱼类人工繁殖与苗种培育技术

⑴ 了解渔场生产规模、经营管理、人员组成、经济效益及相配套的服务体系等。

⑵ 了解渔场主要养殖鱼类的繁殖规模、历年繁殖情况、亲鱼数量和比例，重点掌握四大家鱼的亲鱼培育技术。

⑶ 掌握各种孵化设备的使用、管理和操作技术。

⑷ 熟悉并掌握主要养殖鱼类的雌雄区别，人工繁殖的雌雄配比及其对水质的要求。

⑸ 学会并熟练掌握人工催产技术

⑹ 熟练掌握鱼类人工授精和孵化技术

⑺ 掌握鱼苗和鱼种的培育技术

2、水产经济动物病害防治

⑴ 学习水生经济动物病害的检查、诊断及防治方法，掌握其病害检查、病理解剖、投药的具体操作。

⑵ 学习病变标本、病原体标本的采集方法。

⑶ 细菌标本、真菌标本、原生动物标本、蠕虫标本、寄生虫类标本的病原分离，初步鉴定。

⑷ 营养琼脂培养基平板培养，药敏试验。

⑸ 疾病病理和病原体的电镜照片分析和观察。

3、池塘鱼养殖技术

⑴了解池塘养殖场地的环境条件。

⑵ 了解室内水泥池工业化鱼类养殖。

⑶ 了解鱼类养成的方式与品种搭配。

⑷ 掌握养成的饵料和投饲技术措施。

⑸ 熟悉并掌握鱼病诊断技术和治疗方法。

⑹ 了解和池塘养殖的管理，池塘日志的基本内容

4、大型水域鱼类增养殖技术

⑴ 调查近十年来湖泊水库鱼类粗放养殖的基本情况、鱼种投放、搭配比例、放养密度、鱼类生长速度、渔获物年龄、性比、渔获量、回捕率、拦鱼设施及效果等），了解湖泊水库渔业的历史与现状。

⑵ 结合湖泊水库鱼产力估计判断湖泊水库渔业利用的优势和不足，提出自己的设想。

⑶ 依据湖泊水库渔业资源的现状提出实施粗放养殖的具体的技术方案。

⑷ 观察鱼种投放的方法，现场实施投放的过程。

⑸ 调查拦鱼设施的结构，设置方式，询问拦鱼的效果。提出合理优化的方案。

⑹ 大型水域养殖的配套设施。

四、实习方式和指导方法

（一）实习方式

同学们的兴趣侧重点是不一样的，有的喜欢名特水产养殖，有的更喜欢鱼药生产与销售，有的喜欢鱼类繁殖和鱼苗培育，有的喜欢成鱼养殖。根据同学们的兴趣侧重点不一样，我们采取分类实习的方式，实习方法上采用参观调研和实践操作相结合、集中实习和分散实习相结合的方式进行。鱼类成鱼养殖技术、病害流行特点、渔业经营状态、鱼类增殖与保护等以社会调查、资料收集为主。鱼类人工繁殖技术，病害的诊断和防止实习内容，根据生产实习季节性强的特点，每年在鱼类繁殖季节组织学生按小组进入各个渔场，在带队教师和实习渔场技术员的指导下参与人工繁殖的生产过程，掌握人工繁殖的各个环节的技术，对渔场鱼病病原体进行观察、记录，学会常见鱼病的诊断和防治技术。

（二）指导方法

1、由领导、带队教师、养殖场技术人员、各班班长和团支书组成实习指导小组负责课程实习的联系、安排、指导和协调工作。

2、以各实习点为实习小组，每组指定一名组长负责具体工作。

3、邀请实习单位指派专业技术人员兼任指导教师进行现场实习指导工作。

4、每组定期讨论实习中遇到的问题，指导老师引导解决。

五、成绩评定

实习生在规定的时间内，完成实习任务，由实习单位根据实习生各方面的情况签署考核意见，并评定实习成绩。填写完成《实习成绩考核册》并装订成册。《实习成绩考核册》包括的内容有：社会实践日志、主要实践内容及进程、收获体会、实习单位意见及成绩评定、指导老师成绩评定、社会实践总成绩等。

有下列情况之一者，实习成绩为不及格：

⑴ 未达到实习大纲的基本要求。

⑵ 请假超过实习时间三分之一或以上。

⑶ 实习中严重违反纪律。

⑷ 未交回《实习成绩考核册》。

成绩评定：

平时成绩20%+实习单位成绩40%+实习报告成绩40%

六、注意事项

（一）纪律要求

⑴ 积极参加实习单位安排的一切生产和其他活动，不得无故缺席、迟到或早退。不按规定的时间参加实习或提前离开，均按旷课处理。

 ⑵ 尊重指导教师和实习单位的职工，谦虚谨慎，主动与实习单位的领导、技术人员及工人搞好团结，虚心学习他们的生产技术、经营管理等方面的好经验。

⑶ 爱护实习单位的一切公共财产，所借用的图书资料，仪器物品必须妥为保管、按期归还，如有遗失或损坏，应按单位有关规定赔偿。

⑷ 不得私自调换实习单位，否则按违纪处理。

⑸ 遵守实习单位一切规章制度（包括作息、生产安全），违反纪律，造成恶劣影响的，将受到批评教育、纪律处分或令其停止实习。

⑹ 实习期间注意饮食卫生和乘车安全，严禁独自外出和下河、下塘游泳。

（二）、请假制度

实习生因事、病（应有医生证明）缺课离开实习单位，必须履行请假手续，一天以内由实习单位审批，三天以内由学院审批，三天以上报我校教务处审批。不假离开实习单位按旷课处理。

七、  使用教材及主要教学参考书

本课程选用教材：申玉春主编《鱼类增养殖学》，中国农业出版社，2008

本课程推荐参考书：1、王武主编，2000，鱼类增养殖学，中国农业出版社。

2、王吉桥主编，2000，鱼类增养殖学，大连理工大学出版社。

3、苏锦祥主编，1993，鱼类学与海水鱼类养殖学，中国农

4、史为良主编，1996，内陆水域鱼类增养殖学，中国农业出版社。

综合实践四：毕业综合实习

一、基本信息

课程名称：毕业综合实习

见习周期：8周

先修课程：大纲规定的全部理论教学课程

后续课程：毕业设计

二、实习课程的目的与要求

毕业实习是高等院校培养人才的一个重要实践性教学环节，通过实习，使学生接触生产、科研、企业管理等实际业务，了解社会、了解自己、达到理论与实践相结合，加深对专业的了解，拓宽知识面，提高分析问题和解决问题的实际能力。毕业实习是本专业整个教学过程中对学生科学研究训练，是综合考查学生运用所学知识研究问题及分析问题的一个重要手段，是对学生的水产综合素质、科学研究能力的一种检验，为将要撰写的毕业论文(设计)奠定重要的基础，也是直接检验学生掌握知识的程度、分析问题和解决问题的一份综合答卷。

目的：

1、使学生了解水产养殖技术在生产实际中的应用情况，加深感性认识。

2、通过实践，使学生学会分析和解决生产实际中遇到的问题，培养学生的创新精神和独立工作的能力。

3、培养学生严肃认真的科学态度和严谨求实的工作作风，增强学生的综合素质以及对毕业后工作岗位的适应能力；

4、增强学生劳动观点、集体观念，培养学生正确的人生观，树立良好的社会责任感，引导学生建立正确的择业观。

5、为学生进行毕业设计（论文）提供素材，收集资料。

6、通过参与实际岗位的工作、学习，了解生产和社会实际，培养学生综合运用所学基础知识的基本技能，提高分析问题和解决实际问题的能力，为毕业后从事相关工作打下良好的基础。

基本要求：

1．通过生产实习，使学生理论联系实际，进一步巩固和加深已学的理论知识，培养独立工作和处理生产中有关问题的能力。

2．为了拓宽知识面，提高工作适应能力，要求每个学生必须有较多的时间参加水产生产企业(实习基地)的鱼类人工繁殖，苗种培育，疾病防治等生产实践活动，以加深感性认识，为今后工作奠定良好的基础。

3．结合各实习点具体情况，学生应尽可能地参加一些科学研究工作和社会调查、资料收集整理等工作，以培养进行科学研究工作的能力。实习结束，每个学生必须认真写出一篇生产实习报告。

4．通过直接与实习点的领导、技术人员、工人、群众的接触，学会社交和开展群众工作。

三、实习内容

由于同学们的兴趣爱好和自身性格特点不同，同学们可以根据自身情况、以后的就业方向、毕业论文的需要，选择以下任意板块内容进行实习。

1. 水产动物养殖

进入养殖企业直接从事水产动物养殖工作，参与水产动物养殖生产过程的操作和管理：

（1）熟悉池塘（养殖工厂）清整、消毒操作方法。

（1）熟悉鱼苗投放方案设计和鱼苗投放操作。

（3）学习水质调控、投饵管理、鱼病防治生产过程管理。

(4）了解成鱼销售等生产操作技术。

2. 鱼饲料生产、销售与服务工作

进入饲料厂从事鱼饲料生产、销售与服务方面的工作：

（1）了解鱼饲料生产程序和品质控制要点。

（2）学习与客户沟通技巧，掌握鱼饲料销售方法。

（3）了解客户投诉处理和售后服务。

3. 渔药、调水剂的生产、销售与服务工作

进入渔药厂从事鱼渔药生产、销售与服务方面的工作：

（1）了解渔药生产程序和品质控制要点，了解GMP认证程序。

（2）学习与客户沟通技巧，掌握渔药销售方法。

（3）掌握水质检测、鱼病诊断、施药技术。

（4）了解客户信息收集和投诉处理。

4．到水产科研院所从事相关技术研究协助工作

部分考研同学可以进入如：中国水产科学研究院长江水产研究所、珠江水产研究所，四川省农科院水产研究所等科研单位，从事水产相关科学研究、实验操作、科学调查等科研工作。

（1）加强对水产前沿技术了解。

（2）学习科学研究基本方法。

5. 其他水产相关工作

同学们也可以根据自身情况进入水产电子商务、水产品加工与销售、渔具生产与销售等企业和水产局、水产站等事业单位从事水产相关工作。

四、实习的形式与方法

分散与集中相结合。根据实习内容及毕业课题方向，确定实习方法。包括到企事业工作，跟班组驻点学习生产流程和技术、收集数据，进行社会调查等多种方法。

五、成绩评定

实习生在规定的时间内，完成实习任务，由实习单位根据实习生各方面的情况签署考核意见，并评定实习成绩。填写完成《实习成绩考核册》并装订成册。《实习成绩考核册》包括的内容有：社会实践日志、主要实践内容及进程、收获体会、实习单位意见及成绩评定、指导老师成绩评定、社会实践总成绩等。

有下列情况之一者，实习成绩为不及格：

（1）未达到实习大纲的基本要求。

（2）请假超过实习时间三分之一或以上。

（3）实习中严重违反纪律。

（4）未交回《实习成绩考核册》。

成绩评定：

平时成绩20%+实习单位成绩40%+实习报告成绩40%

六、注意事项

1、纪律要求

（1）积极参加实习单位安排的一切生产和其他活动，不得无故缺席、迟到或早退。不按规定的时间参加实习或提前离开，均按旷课处理。

（2）尊重指导教师和实习单位的职工，谦虚谨慎，主动与实习单位的领导、技术人员及工人搞好团结，虚心学习他们的生产技术、经营管理等方面的好经验。

（3）爱护实习单位的一切公共财产，所借用的图书资料，仪器物品必须妥为保管、按期归还，如有遗失或损坏，应按单位有关规定赔偿。

（4）不得私自调换实习单位，否则按违纪处理。

（5）遵守实习单位一切规章制度（包括作息、生产安全），违反纪律，造成恶劣影响的，将受到批评教育、纪律处分或令其停止实习。

（6）实习期间注意饮食卫生和乘车安全，严禁独自外出和下河、下塘游泳。

2、请假制度

实习生因事、病（应有医生证明）缺课离开实习单位，必须履行请假手续，一天以内由实习单位审批，三天以内由学院审批，三天以上报我校教务处审批。不假离开实习单位按旷课处理。

 

五、考核评价

1、建立学生评价体系：严格按照学校制度要求，建立一套科学、实用的考评体系。实践教学严格按照事先提交的教学计划和教学大纲完成，考核时突出平时成绩的权重，重视对学生学习过程的评价: 采用学生自评、互评, 教师测评相结合的多元化评价主体, 以实验理论、实验操作考核、平时成绩、实验(习)报告、成果评价等多样化考核方法, 客观公正地对学生的实验能力进行评价。而校外实践，考核实习成绩时，还应由实习单位根据实习生各方面的情况签署考核意见，并评定实习成绩，最后填写完成《实习成绩考核册》，内容有：社会实践日志、主要实践内容及进程、收获体会、实习单位意见及成绩评定、指导老师成绩评定、社会实践总成绩等。

2、建立践教学督导和教师评价体系：成立实践教学督导小组，根据学校教学文件，对实践教学过程进行全程监督检查，包括实践教学时间、实践教学服务、实践教学指导、实践教学效果等；尤其对实践教学指导老师进行督导，结合学生评价、同行评价进行评教，促进指导老师严格遵守学校规范，爱岗敬业，悉心指导学生，保证实习的顺利进行。

3、建立激励机制：为实践教学中尽职尽责、评价优秀的教师完善激励制度，在学院评优、绩效分配等方面进行倾斜。

六、保障机制

1、师资队伍

水产养殖学教研室共13名专业教师，博士8名，硕士5名，其中教授2名，副教授6名，拥有四川省教育厅“长江上游鱼类资源保护与开发”科研创新团队和水产养殖校级教学团队，师资力量雄厚，拥有丰富的理论和实践经验。

2、实践基地

依据专业课程体系和产业链，通过校企协同，建立了近50家校外实践教学基地，如正大集团、无锡渔愉鱼科技有限公司、无锡华诺威动物保健有限公司、重庆隆生饲料有限公司、四川省农业科学院水产研究所、都江堰日兴鲟鱼养殖有限公司、内江乡渔专业合作社、内江隆昌兴盛泥鳅养殖公司、眉山永祥全雄黄颡鱼繁殖场等。实践教学内容包括“鱼类增养殖生产实习”、“水产行业入门见习”、“养殖环境生物学与鱼类学课程实习”、“饲料品控与加工工艺实训”、“水产经营与管理实训”、“水族科学实训”、“企业综合实训”、“毕业综合实习”；校外实践教学内容涵盖水产动物养殖、饲料加工与质量检测、水产动物病害诊断与防治（渔药）、渔业设施设备、渔业产品加工、水产设施设备渔业产品及贸易与物流、营销等水产行业产业链。

3、教学改革

水产养殖学专业是学校转型发展重点建设学科，且已被列入四川省普通本科高校应用型示范专业，学校还以水产养殖专业资源为基础，建立了“长江上游鱼类资源保护与利用”四川省重点实验室。现主持四项省级教学改革项目，分别是卓越水产养殖人才培养试点项目（14J001），水产养殖专业综合改革项目（13B004），本科院校专业（群）转型发展改革试点，农科教合作人才培养实践基地（SJ15002）。

4、经费保障

主要依托四个省级教改项目经费约700万，以及校级教改项目的支持，完全能够保证实践教学体系的正常运行。